一种金铁锁毛状根系的诱导与培养方法

摘要

本发明公开一种金铁锁毛状根系高效诱导与培养方法，该诱导与培养方法为：取金铁锁幼嫩茎为外植体进行脱分化处理，获得新鲜金铁锁愈伤组织，将愈伤组织与含有Ri质粒的发根农杆菌(ACCC10060，保藏单位缩写和菌种编号)共培养，以无菌纸吸取多余菌液后转入到诱导培养基中诱导培养，在金铁锁愈伤组织处生长出金铁锁毛状根；抑菌培养后将具有毛状根的外植体放入扩增培养基中进行毛状根的扩大培养。

主权项

一种金铁锁毛状根系诱导与培养方法，其特征在于该方法为：(1)将金铁锁幼嫩茎剪成1～5cm的小段，无菌操作台中用升汞处理6～13分钟，酒精浸泡5～10秒，无菌水冲洗3～8遍后转入到MS+2，4‑D0.5mg/L+NAA0.3mg/L培养基中，25± 3℃ 下暗培养10～35d，获得金铁锁愈伤组织；(2)将发根农杆菌ACCC10060菌株用1μL无菌水稀释后的菌液涂布在20mL YEB固体培养基上，25±3℃下暗培养1～6d长出克隆菌体；(3)挑取1菌环单菌落接种于50mL液体YEB培养基中，25±3℃振荡培养，培养12小时，OD值为0.3～1.2，取1ml菌液置于100mlYEB液体培养基中振荡培养，培养8小时，OD值为0.3～0.9，收集菌液，3500rpm下离心5～15分钟收集菌体；(4)将(3)收集的菌体置于100ml含有100μmol/L乙酰丁香酮、0.9％琼脂的MS固体培养基中并混匀；(5)用(4)混匀后得到的菌液浸染金铁锁愈伤组织10～30分钟，取出后用无菌纸吸取多余的菌液，将浸染的金铁锁愈伤组织接入到含有100μmol/L乙酰丁香酮、0.9％琼脂的MS固体培养基中1～3天；(6)把含有500mg/L头孢噻肟钠的无激素MS固体培养基作为诱导培养基，将(5)浸染后的愈伤组织接入该诱导培养基中，进行抑菌继代培养；每2～9d继代培养一次，至少五次的抑菌培养处理，直至将菌除净；(7)用无激素1/2MS液体培养基作为扩增培养基，将抑菌处理后1g的诱导出来的毛状根放入30mL的扩增培养基中，黑暗悬浮振荡培养，振荡摇床转速为110～120r·min‑1。