主权项 |
一种鉴别牛羊肉真假的LAMP检测方法,其特征是,(1)从GenBank中检索获得牛种属特异性的保守序列,并进行软件比对分析,确定序列的准确性;(2)根据步骤(1)的序列设计多组引物,每组引物包括一对外引物F3/B3和一对内引物FIP/BIP;并利用LAMP实时浊度仪对设计引物进行特异性筛选,确定高度特异性的引物;(3)配置23μL LAMP反应液,构建成检测体系;所述23μL LAMP反应液含有12.5μL 2×等温反应缓冲液、1μL 5μM Primer F3、1μL 5μM Primer B3、2μL20μM Primer FIP、2μL 20μM Primer BIP、1μL Bst DNA聚合酶、3.5μL水;其中:2×等温反应缓冲液含有40mM的pH8.8的三羟基甲基氨基甲烷盐酸盐、20mM的氯化钾、16mM的硫酸镁、20mM的硫酸铵、20%的Tween20、1.6M甜菜碱、2.8mM dNTP;(4)按常规方法提取基因组DNA,取1μL提取的基因组DNA和1μL的荧光检测试剂加入LAMP反应液中,使终反应体积为25μL,10000rpm瞬时离心30秒混匀反应液;(5)置60℃恒温水浴中进行LAMP扩增;(6)根据反应液颜色进行阴阳性判断,若反应液变成绿色,说明待测样品存在牛羊肉;若为桔黄色,则待测样品不存在牛羊肉。 |