筛选肿瘤早期诊断靶标的Small RNA-Seq库的构建方法

摘要

本发明涉及一种筛选肿瘤早期诊断靶标的Small RNA-Seq库的构建方法，尤其是针对单一个体的小量血样构建二代测序用Small RNA-Seq库的方法，本方法通过血浆分离、总RNA提取、RT-PCR及PAGE电泳回收目的片段，构建出能够适用于靶标筛选和目标诊断的Small RNA-Seq库。

主权项

一种针对单一个体的小量血样构建二代测序Small RNA‑Seq库的方法，其特征在于，该方法包括如下步骤：步骤1).血浆分离操作：对新鲜血液样本，利用冷冻离心机，4℃从血液内分两步分离血浆，第一步：400g～600g离心8～15分钟，收集上清以去除血细胞；第二步：1500g～2000g离心8～15分钟，收集上清以充分去除细胞碎片；步骤2).总RNA提取取；对步骤1所获得的血浆样本，使用TRIZOL抽提3‑4次以去除蛋白，抽提完成后加入异丙醇和肝糖，‑80℃沉淀过夜，乙醇洗涤沉淀后用无核酸酶污染的双蒸水重悬沉淀，并进一步浓缩该RNA溶液；步骤3).3’adapter和5’adapter连接：3’adapter连接：在步骤2)获得的总RNA中加入热激后的3’Adapter和连接试剂，于PCR仪上孵育连接；在连按反应获得的溶液中加入RTprimer，于PCR仪上孵育；5’adapter连接：热激后的5’Adapter与上步反应获得的溶液混匀加入相应的连接试剂，置于PCR仪上，孵育连接；利用RNA浓缩法去除溶液中的连接缓冲液、多余的盐离子等，得到与5’和3’Adapter连接的RNA；步骤4).反转录合成cDNA与PCR扩增：反转录：在PCR管中加入来自步骤3)与5和3’Adapter连接的RNA和相应的反转录试剂，混匀，置于PCR仪上，孵育获得cDNA片段，并用PCR扩增所获得的DNA片段步骤5).电泳及胶回收：使用TBE‑PAGE胶电泳上述步骤4)获得的DNA片段，将片段大小在140bp左右的DNA片段切下，并回收其中的DNA，获得的DNA片段即可用于目的样本中的samll RNA的建库与进一步的检测分析。