人卵巢癌细胞系UACC-1598中双微体序列测定方法

摘要

本发明提供了一种人卵巢癌细胞系UACC-1598中双微体序列测定方法，一、人卵巢癌细胞UACC-1598的培养及细胞完整双微体的脉冲场凝胶电泳分离；二、将获得的卵巢癌细胞系UACC-1598的双微体，应用Roche公司454技术对人卵巢癌细胞系UACC-1598中双微体序列进行测定。本发明脉冲分离出来的高纯度DMs很大程度上保证了实验对象的完整性，由于双微体序列的异质性的存在，同时重复性较高，并且总大小只有几十兆碱基的特点，更适合采用Roche的454高通量测序技术进行分析，从而实现对其序列全貌及特征的全面认识，很大程度上保证了所得序列的真实性。

主权项

一种人卵巢癌细胞系UACC‑1598中双微体序列测定方法，其特征在于，步骤如下：一、人卵巢癌细胞UACC‑1598的培养及细胞完整双微体的脉冲场凝胶电泳分离；1、样品制备人卵巢癌细胞UACC‑1598在含10％FBS的RPMI‑1640培养基中，于5％CO2、37℃条件下进行培养；收集对数生长期、汇合率为70％～80％的人卵巢癌细胞UACC‑1598，计数后重悬于PBS，使细胞密度为1～2×108细胞/mL，并在37℃水浴中孵育；加入等体积37℃的1.4％低熔点琼脂糖，迅速混匀后倒入洁净模具中，4℃放置10～15min使其凝固；将胶块从模具中取出后置于3～5倍体积的细胞裂解液中于37℃水浴中震荡孵育约90min至胶块透明；弃细胞裂解液并用洗液反复洗胶块3次后置于3～5倍体积的蛋白酶K溶液，37℃水浴中震荡孵育6～12小时；洗涤三次后，置于贮存液中4℃保存；2、脉冲场凝胶电泳将制备好的胶块置于0.5％琼脂糖凝胶的点样孔中，用相同浓度的琼脂糖封闭加样孔；在10℃的0.5×TBE电泳缓冲液中适宜电泳条件下先进行第一向FIGE模式电泳，电泳条件为：正向电压梯度：3～5V/cm，起始转换时间：50～70seconds，终止转换时间：220～260seconds；负向电压梯度；2～4V/cm，负向起始转换时间：15～30seconds，负向终止转换时间：50～70seconds；总电泳时间：36～45hours，随后调整方向进行第二向CHEF模式电泳，分离大片段DNA分子；电泳条件为：电压梯度：3～6V/cm，脉冲角度：120，起始转换时间：100～130seconds，终止转换时间：270～320seconds，电泳时间：25～30hours，以商品化的H.wingi和S.cerevisiae染色体为分子量标尺；3、琼脂糖酶法回收DMs DNA对电泳凝胶中的垂直DNA条带进行切胶回收，切取含有目的DNA片段的低熔点琼脂糖凝胶，切成细块并称重，加入1/10体积的10×琼脂糖酶缓冲液用于平衡反应体系；于 70℃10min熔化低熔点琼脂糖凝胶后，冷却至60℃并静置5min，加入琼脂糖酶于60℃消化1小时，冰上放置15min后12000r/min离心15min，取上清液并加入1/10体积3mol/L乙酸钠溶液和1倍体积的异丙醇，混匀后‑20℃冷却6～12小时，12000r/min离心15min，弃上清用70％的冷异丙醇清洗沉淀两次，干燥后加入TE溶解DNA沉淀，用1.5％琼脂糖凝胶电泳检测回收所得DNA片段大小；二、将获得的卵巢癌细胞系UACC‑1598的双微体，应用Roche公司454技术对人卵巢癌细胞系UACC‑1598中双微体序列进行测定；1、待测DNA文库的构建：把待测DNA用喷雾法打断成300‑800bp的小片段并在小片段两端加上不同的接头，或将待测序列变性后用杂交引物进行PCR扩增，连接载体，构建单链DNA文库；2、Emulsion PCR：将这些ssDNA与水油包被的直径28μm的磁珠在一起孵育、退火，磁珠表面含有与接头互补的寡核苷酸序列，ssDNA会连接到磁珠上；同时孵育体系中含有PCR反应试剂，反应完成后，富集带有DNA的磁珠；经过扩增反应，每一个小片段都将被扩增100万倍，从而达到下一步测序反应所需的模板量；3、测序：测序反应采用焦磷酸测序法，以磁珠上大量扩增的ssDNA为模板，每次反应加入一种dNTP进行合成反应；dNTP能与待测序列配对，会在合成后释放焦磷酸基团，释放的焦磷酸基团会与反应体系中的ATP硫酸化酶反应形成ATP，生成的ATP和荧光素酶共同氧化反应体系中的荧光素分子并发出荧光，测序反应产生的荧光信号由CCD照相机记录，再经过计算机分析转换为测序结果；由于每种dNTP在反应中产生的荧光颜色不同，根据荧光的颜色来确定被测分子的序列；反应结束后，游离的dNTP会在双磷酸酶的作用下降解ATP，导致荧光淬灭，从而使反应体系再生；测序反应共获得154，294条序列，平均长度425bp，测序反应即告成功。