基于E2基因的可插入式猪瘟病毒cDNA载体构建及应用

摘要

本发明涉及生物技术领域，旨在提供一种基于E2基因的可插入式猪瘟病毒cDNA载体构建及应用。该构建方法包括：以含有猪瘟病毒疫苗C株基因组5’半长的重组质粒pA-F123为模板，用限制性内切酶SpeI和NsiI进行酶切，酶切产物经割胶回收后获得纯化的pA-ΔE2-F123质粒；用BamHI和SalI将含有猪瘟病毒疫苗C株基因组3’半长的F456片段从重组质粒pB-F456中切下，克隆于相同酶作用的pA-ΔE2-F123中，获得重组质粒pA-ΔE2-FL22。本发明构建的可插入式cDNA载体，可根据该病的流行形势，快速、方便的拯救携带不同基因型E2基因的重组C株病毒；重组病毒E2基因中引入探针标记序列可应用于荧光定量PCR鉴别检测方法中。拯救的重组病毒保留C株在兔体内复制以及对自然宿主猪无致病力等特性。

主权项

一种基于E2基因的可插入式猪瘟病毒cDNA载体的构建方法，包括步骤：(1)以pBR322为模板进行改造，获得用于克隆CSFV基因组3’‑半长的质粒pB‑CN；具体步骤为：应用引物pGEM‑U：GGGAAGCTTGGATCCTATAGGGCGAATTGG  和pGEM‑L：CCGCCCGGGCAAGCTATTTAGGTGACAC，扩增含有质粒pGEM‑5ZF(+)，多克隆位点的171bp片段，并在该片段的前后分别引入酶切位点HindIII和AvaI，获得中拷贝质粒pB‑CN；以低拷贝质粒pACYC‑177为模板进行改造，获得用于克隆CSFV基因组5’‑半长和基因组全长的质粒pA‑CN；具体步骤为：应用引物pA‑U：GCGGACTAGTACGCGTTCTAGAGCGCGGAACCCCTATTTG和pA‑L：TGGATCCGCGGCCGCGTCGACCCCCTTGTATTACTGTTTATGT，在删除pACYC‑177多余卡那抗性基因的同时，引入6个酶切位点用于半长和全长的克隆，获得低拷贝质粒pA‑CN；(2)CSFV 5’‑半长的组装：首先分别用限制性内切酶XbaI/SpeI，SpeI/PstI和NotI/SalI将F1，F2和F3片段克隆于质粒pA或pGEM‑5ZF(+)中，获得相应重组质粒F1‑pA，F2‑pGEM和F3‑pGEM；在F1片段基因组5’‑非编码区的上游引入T7RNA聚合酶的启动子用于全长cDNA的体外转录；然后用PstI和SalI将F3从F3‑pGEM中切下，克隆于用相同酶作用的F2‑pGEM，获得重组质粒F23‑pGEM；再用SpeI和BamHI将F23从F23‑pGEM中切下，克隆于用相同酶作用的F1‑pA，获得含有CSFV 5’‑半长的重组质粒F123‑pA；CSFV 3’‑半长的组装：首先分别用限制性内切酶BamHI/NcoI和NcoI/NotI将F4，F5片段克隆于质粒pB中，获得相应重组质粒F4‑pB和F5‑pB；而F6片段则克隆于pSIMPLE‑19EcoR V/BAP Vector载体中，获得重组质粒F6‑pUC；然后用NcoI/NotI将F5从F5‑pB中切下，克隆于用相同酶作用的F4‑pB中，获得重组质粒F45‑pB；再用BstBI和SalI将F6从F6‑pUC中切下，克隆于用相同酶作用的F45‑pB，获得含有CSFV 3’‑半长的重组质粒F456‑pB；(3)以重组质粒pA‑F123为模板，选择其E2基因序列中5’‑端的限制性内切酶SpeI和3’‑端的NsiI进行酶切，酶切产物经割胶回收后获得纯化的pA‑ΔE2‑F123质粒；用BamHI和SalI将含有C株基因组3’‑半长的F456片段从重组质粒pB‑F456中切下，克隆于用相同酶作用的pA‑ΔE2‑F123中，获得重组质粒pA‑ΔE2‑FL22。