一种大肠杆菌NrfA基因表达蛋白多克隆抗体及其制备方法

摘要

一种大肠杆菌NrfA基因表达蛋白的多克隆抗体制备方法：以大肠杆菌基因组DNA为模板，PCR扩增得到NrfA基因编码区，构建pET-28a（+）-NrfA表达载体，转入大肠杆菌BL21（DE3）后，经IPTG诱导表达并纯化重组蛋白；再免疫新西兰雄兔，制备多克隆抗体；免疫获得的多克隆抗体用ELISA检测，其效价为1：204900，经Westernblotting分析，抗体的特异性较好。该多克隆抗体可用于研究其他微生物中亚硝酸盐还原酶与大肠杆菌亚硝酸盐还原酶之间的相关结构与功能。也为进一步深入研究大肠杆菌亚硝酸盐还原酶的作用机理与活性调节提供基础。

主权项

一种大肠杆菌NrfA基因表达蛋白多克隆抗体，其特征在于通过如下方法制备：（1）、大肠杆菌基因组DNA的提取按Omega公司细菌基因组DNA提取试剂盒的使用方法提取大肠杆菌基因组DNA；所述的大肠杆菌为BL21（DE3）；（2）、目的基因NrfA的PCR扩增上游引物为CGGGATCCATGACAAGGATAAAAATAAACG；下游引物为GGCCTCGAGTTATTGGCTTAACAGACC；以步骤（1）提取的大肠杆菌基因组为模板，通过PCR扩增目的基因片段，PCR反应条件为：94℃预变性4min；94℃变性45s，60℃退火45s，72℃延伸45s，共30个循环；72℃延伸10min，得PCR扩增产物；（3）、重组质粒pET‑28a（+）‑NrfA的构建将（2）所得的PCR扩增产物经BamHⅠ和XholⅠ分别在GGATCC、CTCGAG位点双酶切，回收目的片段NrfA，与经同样酶切并回收后的pET‑28a（+）表达载体在10 ×T4 连接酶缓冲液中采用T4 DNA 连接酶进行连接，连接产物再转化大肠杆菌E.coli TG1细胞，得到重组质粒pET‑28a（+）‑NrfA；（4）、NrfA蛋白的表达、纯化将步骤（3）所得的重组质粒pET‑28a（+）‑NrfA转化大肠杆菌BL21（DE3）进行表达，挑取单克隆培养后，所得的阳性克隆培养物以2%接种量接种于卡那霉素含量为50mg/ml的LB培养基，37℃摇床培养至对数生长期，加入终浓度为1mmol/l的IPTG进行诱导，37℃、220r/m摇床培养4h；离心收集菌体，菌体经pH7.4的PBS洗涤三次，超声波裂解细胞，离心收集沉淀；沉淀依次经洗涤液Ⅰ、洗涤液Ⅱ、溶解液III分别洗涤三次，每次转速6000rpm，最后得到的沉淀部分即为粗NrfA目的蛋白；所述的洗涤液Ⅰ为50mmol/L Tris‑HCl，1mmol／L EDTA ,1% TrionX‑100 ，pH8.0；所述的洗涤液II为20mmol/L Tris‑HCl，1mmol／L EDTA，4mol/ L尿素，pH8.0；所述的洗涤剂III为50mmol/L Tris‑HCl，1mmol／L EDTA，8mol/ L尿素， 5mmol／Lβ‑巯基乙醇，pH8.0；      将粗NrfA目的蛋白经超滤管离心超滤脱去脲素即得NrfA目的蛋白；（5）、多克隆抗体的制备将步骤（4）所得的NrfA目的蛋白经pH7.4的PBS溶液调整，使其终浓度为0.2mg/ml，再以1：1比例与弗氏完全佐剂混合，常规方法免疫新西兰雄兔1次，按同样方法，1：1比例与弗氏不完全佐剂混合，再免疫雄兔2次，然后颈动脉取血，分离血清，即得到一种大肠杆菌NrfA基因表达蛋白多克隆抗体。