嗜热羧酸酯酶基因工程菌的构建及其酶的应用

摘要

本发明提供了一种嗜热羧酸酯酶基因工程菌的构建及其酶的应用。嗜热羧酸酯酶(DtEstA)基因来源于嗜热圆锥网团菌DSM6724(Dictyoglomus turgidumDSM6724)；本发明采用生物工程技术，通过细菌的培养、目的基因钓取、构建表达载体、及将载体转化到宿主细胞中等步骤构建成嗜热羧酸酯酶基因工程菌，再经细胞培养、收集沉淀、超声破碎、热处理、亲和层析等步骤纯化获得嗜热羧酸酯酶DtEstA。本发明的嗜热羧酸酯酶DtEstA具有很好的热稳定性，及对金属离子、有机溶剂及表面活性剂的抗性，可用作化学合成和食品加工过程中很好的生物催化剂。

主权项

一种嗜热羧酸酯酶基因工程菌的构建，所述的嗜热羧酸酯酶基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，其特征在于：包括以下步骤：A、嗜热圆锥网团菌DSM 6724的培养按照DSMZ的配方配置厌氧培养基，按照100体积份的厌氧培养基注入1体积份圆锥网团菌DSM 6724的比例将圆锥网团菌DSM 6724接种到厌氧培养基中进行培养；B、基因组DNA的提取将步骤A培养的嗜热圆锥网团菌DSM 6724用细菌基因组DNA提取试剂盒提取嗜热圆锥网团菌DSM 6724的基因组，得到基因组DNA溶液；C、引物设计及用PCR法钓取嗜热羧酸酯酶目的基因引物设计如下：上游引物：5’GATATACCATGGCGCTCCCAGCCCTCTTCTTTCTT 3’，划线部分为Nco I的酶切位点；下游引物：5’CGCCGCGGATCCGGTCTTTTCCTTTGCTCAAATAAC3’，划线部分为BamH I的酶切位点；以步骤B所得基因组DNA溶液为模板，在上述上游引物和下游引物的参与下进行PCR反应，得到PCR扩增产物，再对扩增产物进行纯化，得到纯化的PCR产物，然后用限制性内切酶Nco I和BamH I进行双酶切，得到含有粘性末端的嗜热羧酸酯酶目的基因；D、构建重组表达载体以pET28a为载体，对载体用限制性内切酶Nco I和BamH I进行双酶切，然后用连接试剂盒与步骤C所得含有粘性末端的嗜热羧酸酯酶目的基因进行连接，得到重组表达载体；E、将重组表达载体转化到宿主细胞中将步骤D所得重组表达载体转化到大肠杆菌BLP感受态细胞中进行培养，得到嗜热羧酸酯酶基因工程菌。