一种藻类内生真菌胞外多糖的制备方法

摘要

本发明一种藻类内生真菌胞外多糖的制备方法，涉及使用生物方法合成多糖，是以蓝藻内生真菌DT06为生产菌，通过摇床或液态深层培养发酵分离纯化的多糖，生产菌为蓝藻内生真菌DT06，该菌株的保藏日期为：2010年12月20日，保藏编号为：CGMCC4460；具体步骤是：第一步，蓝藻内生真菌TD06液体发酵；第二步，胞外多糖分离；第三步，多糖纯化，最后制得有如下结构式所示的纯真菌胞外多糖产品：本发明方法所用内生真菌DT06是从蓝藻中分离出来的，克服了现有技术的原料来源不广泛，不易于分离和生产成本高的缺点。

CGMCC NO. 44602010.12.20

主权项

1.一种藻类内生真菌胞外多糖的制备方法，其特征在于：是以蓝藻内生真菌DT06为生产菌，通过摇床或液态深层培养发酵分离纯化的多糖，其具体步骤是：生产菌为蓝藻内生真菌DT06，该菌株已在中国普通微生物菌种保藏中心专利保藏，保藏日期为：2010年12月20日，保藏编号为：CGMCC4460，该菌株的核苷酸序列见序列表；该菌株的名称为Simplicillium lanosoniveum(J.F.H.Beyma)Zare & W.Gams var.tianjinienss Q.L.Dong。斜面培养基配方：葡萄糖0.5～1g、酵母提取物0.05～0.1g、蛋白胨0.1～0.2g、琼脂1～1.5g和水100ml，制成试管斜面，挑取菌丝接入斜面；第一步，蓝藻内生真菌TD06液体发酵发酵培养基配方为：蔗糖30～60g/L，硝酸钠2～3g/L，磷酸二氢钾0.5～1g/L，氯化钾0.1～1g/L，七水硫酸镁0.1～0.5g/L，硫酸铁0.01～0.1g/L；将蓝藻内生真菌DT06进行液体发酵，选用以下两种方法的任意一种：A.蓝藻内生真菌TD06的摇床发酵控制参数为：发酵温度25～27℃，摇床转数为130～150rpm，装料系数为30～50％(v/v)，接种量为1～10％(v/v)，pH控制在5.5～6.5，发酵周期为6～8天，B.蓝藻内生真菌TD06的深层发酵控制参数为：装料系数为75～90％(v/v)，接种量为1～20％(v/v)，pH＝5.5～7.0，温度25～30℃，罐压0.01～0.5Mpa，搅拌速度60～150rpm，空气流量0.4～1.0vvm；第二步，胞外多糖分离将第二步得到的蓝藻内生真菌TD06液体发酵物进行离心或过滤，除去菌体，将发酵液加热浓缩至原体积的1/2～1/4，用95％(v/v)的乙醇来沉淀提取粗多糖，将该留取的粗多糖沉淀，乙醇的用量是体积比为：上述浓缩的发酵液∶95％乙醇＝1∶1，再加入为上述粗多糖沉淀2～4倍体积的水，煮沸10～15分钟，然后加入质量百分比为0.2～2％的活性炭，搅拌除去色素，离心后取上清，将该上清再浓缩至原体积的1/2～1/4后加入与其体积比为1∶1的95％(v/v)的乙醇进行沉淀，将得到的沉淀在15Pa和-50℃条件下进行真空干燥24h，得到多糖粗品；第三步，多糖纯化将第三步得到的多糖粗品经过Sevag法除蛋白、透析和Sephadex G-200凝胶过滤，最后制得有如下结构式所示的纯真菌胞外多糖产品：该结构式所示分子中，葡萄糖和半乳糖的比例为2∶1，其主链由2个葡萄糖分子通过α-(1-4)糖苷键连在一起，再以α-(1-6)半乳糖链接而成。