人源凝血因子Ⅺ催化结构域的表达、纯化及结晶

摘要

本发明提供了人凝血因子XI催化结构域突变体。本发明提供了一种人凝血因子XI催化结构域突变体(N432Q/N473Q/C482S)在巴斯德毕氏酵母中高效稳定表达、纯化以及结晶的技术方法。本发明培养的人凝血因子XI催化结构域突变体晶体空间群为P3₁，单胞参数为：α＝β＝90°，γ＝120°。该蛋白不需要任何激活就有丝氨酸蛋白酶活性，可用于人凝血因子XI抑制剂的高通量筛选；而其所结晶出的高分辨率晶体，则为人凝血因子XI抑制剂的设计、开发提供一个研发平台。

主权项

人凝血因子XI催化结构域突变体的表达方法，其特征在于：本突变体在巴斯德毕氏酵母体系中表达，并且包含如下步骤：(1)以肝库为模板，用PCR法从肝库扩增出FXI催化结构域，正向引物S(5‘‑3’)：CCGCTCGAGAAAAGAATCGTTGGAGGAACTGC；反向引物AS(5‘‑3’)：ACGCGTCGACTCACACTGCTTGAGTTTTCTCCA，引物分别含Xho I和Sal I位点(用下划线标注)，用Xho I和Sal I双酶切FXI催化结构域片段和载体pPICZαA；将处理好的片段和载体用T4DNA连接酶16℃连接过夜，转化感受态Top10F′菌，用含有Zeocin抗性的平板筛选阳性克隆，DNA测序鉴定；采用重叠延伸PCR的方法对FXI催化结构域基因的432和473位点进行定点突变，第一轮PCR：以构建好含有FXI催化结构域基因的质粒为模板，分别用正向引物P1 S：ATCGTTGGAGGAACTGCGTCTGTTC  和反向引物P1 AS：TCACACTGCTTGAGTTTTCTCCAGA进行第一轮PCR，PCR产物用DNA胶回收试剂盒回收纯化；第二轮PCR：以第一轮PCR回收得到的DNA片段为模板，用正向引物P2 S：GGCATTTTACAACAATCTGAAATA和反向引物P2 AS：GAATCTGTGTATTGCACTGTGGTTT进行扩增，并回收目的DNA片段；第三轮PCR：以第一轮PCR回收得到的DNA片段为模板，用正向引物P3 S：AAACCACAGTGCAATACACAGATTC  和反向引物P1 AS  ：TCACACTGCTTGAGTTTTCTCCAGA进行扩增，并回收目的DNA片段；第四轮PCR：以第一轮PCR回收得到的DNA片段为模板，用正向引物P1 S：ATCGTTGGAGGAACTGCGTCTGTTC和第二轮PCR的产物为反向引物进行扩增，并回收目的DNA片段；第五轮PCR：以第三轮和第四轮PCR回收得到的2个DNA片段为模板，用带有Xho I和Sal I的正反引物，扩增出一条完整的带有突变位点的FXI催化结构域基因，克隆至pPICZαA载体，转化感受态Top10F′菌，用含 有Zeocin抗性的平板筛选阳性克隆，DNA测序鉴定；以构建好的pPICZαA‑rhFXI370‑607(N432Q/N473Q)质粒为模板，通过定点突变C482S，正向引物：AACGACCCATATCTCTGCCTTCC，反向引物：GGAAGGCAGAGATATGGGTCGTT构建重组质粒pPICZαA‑rhFXI370‑607(N432Q/N473Q/C482S)，克隆测序；(2)目的基因的克隆与表达：酶切去磷酸化的PCR回收产物连接到表达载体pPICZαA上，重组质粒转入大肠杆菌进行扩增，抽提质粒，测序；测序正确后，大量抽提重组质粒，重组质粒经Sac I酶切后，电转入新制的感受态细胞X‑33，重组的转化子在甲醇的诱导下表达的蛋白分泌在培养液中，SDS‑PAGE电泳检测培养液中含有与目的蛋白相同分子量的条带。