一种克隆细菌基因cDNA全长的方法

摘要

一种克隆细菌基因cDNA全长的方法，属于生物基因技术领域，其方法是：a、总RNA的提取，利用细菌总RNA提取试剂盒或TRIzol试剂提取细菌总RNA；b、总RNA的自连环化，c、第一链cDNA的合成；d、朝向5’UTR和3’UTR的引物分别命名为IP1和IP2；以IP1和IP2为引物，获得基因5’UTR和3’UTR序列；e、双链cDNA片段的连接与测序，利用载体通用引物进行测序；f、利用DNA序列分析软件将步骤e中所获得的序列与基因编码区序列进行拼接，便可获得基因的cDNA全长。有益效果是：cRT-PCR方法可靠，结果准确，并且所得结果相对于S1 nuclease mapping和primer extension法要更加便捷高效；能确切地展示细菌基因转录本的真实情况。所以，该方法将极大提高细菌基因表达调控的研究进度和准确性。

主权项

一种克隆细菌基因cDNA全长的方法，其方法是：a、总RNA的提取，利用细菌总RNA提取试剂盒或TRIzol试剂提取细菌总RNA；b、总RNA的自连环化，自连环化按如下方法进行，取浓度为600‑1000ng/μL的总RNA溶液5μL，T4RNA连接酶buffer 2μL，T4RNA连接酶5U，DNA酶抑制剂1μL，加dd H2O至20μL；16℃连接20h后，将连接产物用10μL氯仿抽提一次，然后用2.5倍体积无水乙醇沉淀RNA，用5μL ddH2O重溶RNA备用；c、第一链cDNA的合成，将自连环化的总RNA，利用六核苷酸随机引物进行逆转录，合成第一链cDNA；d、双链cDNA的合成，针对目的基因设计反向引物，朝向5’UTR和3’UTR的引物分别命名为IP1和IP2；以合成的第一链cDNA为模板，以IP1和IP2为引物，进行PCR反应，同时获得基因5’UTR和3’UTR序列；e、双链cDNA片段的连接与测序，将步骤d中所述的PCR产物连接到T载体上，利用载体通用引物进行测序；f、基因cDNA全长的拼接，利用DNA序列分析软件将步骤e中所获得的序列与基因编码区序列进行拼接，便可获得基因的cDNA全长。