人胚皮层神经干细胞的原代细胞的分离培养方法

摘要

本发明提出一种人胚皮层神经干细胞的原代细胞的分离培养方法，其其应用于人胚皮层神经干细胞的分离和培养过程，所述人胚皮层神经干细胞的分离和培养过程包括步骤：原代细胞的分离和培养；传代培养及单细胞克隆、传代；克隆诱导分化；以及间接免疫荧光检测。本发明采用无血清培养和单细胞克隆技术从从胚龄12周的新鲜人胚皮层中成功建立一株人胚神经干细胞，该细胞具有连续克隆能力，可传达培养，表达神经巢蛋白抗原。分化后的细胞表达神经元细胞、胶质细胞和少突胶质细胞的特异性抗原。

主权项

一种人胚皮层神经干细胞原代细胞的分离培养方法，其应用于人胚皮层神经干细胞的分离和培养过程，所述人胚皮层神经干细胞的分离和培养过程包括步骤：原代细胞的分离和培养、传代培养及单细胞克隆和传代、克隆诱导分化以及间接免疫荧光检测；所述原代细胞的分离和培养方法如下：取胚龄12周水囊引产的新鲜人胚胎，在无菌条件下分离出胎脑大脑皮层，剥离硬膜及表面血管，在DMEM/F12(1∶1)的细胞培养液中漂洗三次，用细吸管反复吹打瓶内组织碎块至完全散开，制成细胞悬液；使用100目不锈钢网过滤，制成单细胞悬液，经分胎蓝染色计数活细胞加入含B27和bFGF的DMEM/F12无血清培养基，调整细胞含量为1×105ml‑1，将细胞悬液分装于25ml细胞培养瓶，每瓶3ml，37℃，5％CO2条件下静置培养7天。