棉花PMC单染色体分离及其特异分子标记建立的方法

摘要

本发明涉及分子标记领域，具体地，涉及棉花PMC单染色体分离及其特异分子标记建立的方法。根据本发明的方法包括取材、鉴定、显微切割目标染色体等步骤，并以分离的单染色体为材料，构建DNA文库、克隆随机测序后，利用标记软件开发分子标记，并将其定位在棉花特定染色体上。本发明的PMC切割方法只要有对应的单体材料即可，目前棉花26条染色体大部分都有；PMC切割更精确，假阳性低，但同时技术难度大，中期细胞少，目标染色体数量少，一个细胞只有一条。

主权项

棉花花粉母细胞单染色体分离方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：(1)取材、鉴定A.制作减数分裂中期染色体膜载片，切割与膜片内框大小相近的玻璃载片，将膜载片粘贴在完整的玻璃载片适当位置，再将膜载片反扣在支架上，所述膜片的材料为PET膜载片；B.取材，所用材料为棉花单体材料，取少许花药于玻璃载片，滴加卡宝品红染色，捣碎，除余渣，加盖片压片，压片完成后，镜检，在显微镜下直接观察，识别出有单个细胞且整体呈红色，外周有半透明状边圈的花蕾选用；C.预处理采用改良卡诺II，其配方为：乙醇∶冰乙酸∶氯仿＝5∶3∶2作为固定剂，室温下处理4h，其中固定液为样品的5倍以上，固定后用70％乙醇4℃保存，(2)显微切割目标染色体水洗预处理后的花蕾、低渗、酶解，将花药点在半片盖玻片上，加卡宝溶液并用镊子夹碎染色，将半片盖玻片反扣在垫有支架的膜载片上，轻轻按压，‑20℃存放，取出有凝结水时快速揭片，去掉支架，干燥，进行显微切割，并收集目标染色体。