慢病毒基因转移载体、其制备方法和应用

摘要

本发明公开了一种马传染性贫血病毒(EIAV)基因转移载体、其构建方法及其用途。本发明载体包含：CMV/R/U5启动子、5’非翻译区引导序列、部分5’gag基因编码区序列、聚嘌呤序列和EIAV的Rev反应元件、CMVIE/鸡β-actin启动子、报告基因、土拨鼠肝炎病毒转录后调控元件、多克隆位点、EIAV 3’LTR之前的poly(A)信号、完整的3’LTR以及真核表达载体的部分序列。本发明载体具有慢病毒载体的共有优点，缺少所有野生型病毒辅助基因，并可以携带一个或多个选定基因以传送给靶细胞，能够插入大片段的目标DNA序列，能够使外源基因和报告基因在细胞中高水平的表达。

主权项

一种构建源于马传染性贫血病毒的缺陷型慢病毒基因转移载体的方法，其特征在于包括以下步骤：(1)PCR扩增EIAV驴白细胞弱毒疫苗株的3’LTR和邻近的聚嘌呤序列；PCR引物为VDLA‑F5：5’‑ATA TGC GGC CGC TAG AAA AAC AAG GGG GCA AC‑3’和VDLA‑R4：5’‑GCC CGG ATC CAT CGA TTG TTA GAT CTT GAA AAC‑3’；所述的EIAV驴白细胞弱毒疫苗株的全基因核苷酸序列GenBank号为AF327878；(2)步骤(1)得到的PCR产物经过NotI和BamHI酶切后，T4DNA Ligase连接插入同样酶切处理后的pCI质粒，再用Sac I和Nhe I酶切，T4 DNA Ligase连接使同样酶切处理后的扩增自EIAV基因组的5’末端序列插入其中，用于扩增EIAV基因组的5’末端序列的PCR引物为VDLA‑F3：5’AAG CAG AGC TCG TTT AGT GAA CCA AAC GCT CAG ATT CTG CGG TC‑3’和VDLA‑R3：5’‑CGG CTA GCT AGC AAT AGT ACT TGT TTT TGT CCT GCT TGT CC‑3’；然后，用NheI和Not I分别处理该质粒和pEGFP‑N1载体，将pEGFP‑NI载体上的多克隆位点和增强绿色荧光蛋白基因连接插入到其中，得到含有多克隆位点和增强绿色荧光蛋白基因的重组载体；(3)KpnI单酶切步骤(2)得到的重组载体，并用碱性磷酸酶去磷酸化，将同样酶切处理后的以pCAGG‑MCS为模板PCR扩增的CMVIE/鸡β‑actin启动子用T4DNA Ligase连接插入其中，扩增所用的引物为3U28：5’‑GGG GTA CCA CTA GTT ATT AAT AGT AAT C‑3’；492L25：5’‑TAT GGT ACC GCA GCG ACT CCCGCC C‑3’；利用Spe I酶酶切筛选CMVIE/鸡β‑actin启动子正向插入的重组质粒载体；(4)用PCR扩增EIAV‑DLA的RRE序列，所述的EIAV‑DLA的全基因核苷酸序列GenBank号为AF327878，用于PCR扩增的引物为CPPRRE‑F1：5’‑CCT GCT AGC TTG TAA CAA AGG GAG GGA AAG TAT GTG GTG TAT GGG ATT AT‑3’和CPPRRE‑R2：5’‑CGG CTC GAG TTT TGA CAG TGA TCA CTA TCC ACA GAA GAT GTC CTG TAT‑3’，引物中引入EIAV‑DLA的中央聚嘌呤序列，分别用NheI和Xho I双酶切处理PCR产物和步骤(3)得到的重组质粒载体，胶回收PCR产物目的片段和重组质粒载体片段，然后用T4DNA Ligase连接，将EIAV‑DLA的中央 聚嘌呤序列和RRE序列插入到载体中；用Not I单酶切载体，并用碱性磷酸酶去磷酸化，将同样酶切处理后的以土拨鼠肝炎病毒为模板扩增的WPRE用T4DNA Ligase连接插入其中，土拨鼠肝炎病毒的GenBank登录号为J04514和NC004107，引物为1082U30：5’‑CTG GCG GCC GCA ATC AAC CTC TGG ATT ACA‑3’和1709L30：5’‑CGC GCG GCC GCA CAG GTG AAG ACC AAG CAA‑3；利用Sac II酶酶切筛选WPRE正向插入的重组质粒载体，即得所述的缺陷型慢病毒基因转移载体。