焦磷酸测序技术鉴别禽流感病毒亚型的方法

摘要

本发明属于动物病原检测技术领域，涉及一种采用焦磷酸测序技术鉴别禽流感病毒亚型的方法，先设计禽流感病毒H5、H7、H9、N1和N2特异性引物及焦磷酸测序引物；再提取待测样品的核糖核酸，然后分别用各亚型的引物进行逆转录-聚合酶链式反应扩增；用进行琼脂糖凝胶电泳对扩增产物检测，若H5、H7、H9、N1和N2引物扩增片段长度分别为127bp、222bp、174bp、269bp、101bp，则制备焦磷酸测序单链模板，再进行焦磷酸测序反应，最后根据扩增结果和焦磷酸测序结果判定样品中禽流感病毒的亚型；本发明吸收了RT-PCR和DNA测序技术的优势，应用特异序列的测定满足对分子诊断的需要，使得亚型鉴定结果可靠，方法快捷。

主权项

一种焦磷酸测序技术鉴别禽流感病毒亚型的引物，其特征在于所述的引物设计是根据DNASTAR软件的同源性分析结果，选取禽流感病毒H5、H7、H9、N1和N2各个亚型中的保守序列设计上游引物、下游引物和测序引物，其禽流感病毒H5、H7、H9、N1和N2特异性引物及测序引物、特征序列分别为：H5亚型上游引物：5’‑ACATTTCCGTTGGAACATCAACA‑3’H5亚型下游引物：5’‑ATGGCATCATTCGGCTTTAAAA‑3’，5’进行生物素标记；H5亚型测序引物：5’‑CAACACTGAACCAGAGATT‑3’，扩增片段长度为127bp；H5亚型特征序列：5’‑GGTACCGAAAATA‑3’H7亚型上游引物：5’‑AAACAATGGGATTCACATACAGC‑3’，5’进行生物素标记；H7亚型下游引物：5’‑ATTTGGTCTGTTCTGTGGTTGATC‑3’H7亚型测序引物：5’‑GCATAGAATGAAGATCCTG‑3’，扩增片段长度为222bp；H7亚型特征序列：5’‑AGAT‑3’H9亚型上游引物：：5’‑TGTGTCTTACAATGGGACAAGC‑3’，5’进行生物素标记；H9亚型下游引物：5’‑CGGTGGGTGGGTGATTTA‑3’H9亚型测序引物：5’‑TGATTTATGCCCCAC‑3’，扩增片段长度为174bp；H9亚型特征序列：5’‑TCTTTTCAT‑3’N1亚型上游引物：5’‑GGTTCCAAGGGGGATGTGT‑3’，N1亚型下游引物：5’‑GGGCCAGAAATTCCAATTGT‑3’，5’进行生物素标记N1亚型测序引物：5’‑CCTGCTATAGCTCCAAA‑3’，扩增片段长度为269bpN1亚型特征序列：5’‑AACTCAAGG‑3’N2亚型上游引物：5’‑AGGCTCTCTGCAAGTGGAGATA‑3’，5’进行生物素标记N2亚型下游引物：5’‑AAGGTAGTCCCCTGCCCAAGT‑3’N2亚型测序引物：5’‑GACCGCATGATACATAAGT‑3’扩增片段长度为101bpN2亚型特征序列：5’‑ACAAGAGAA‑3’。