一种固氮螺菌的发酵方法与由该方法得到的发酵液及其用途

摘要

本发明涉及一种固氮螺菌的发酵方法，还涉及由该方法得到的发酵液及其用途。本发明的固氮螺菌发酵方法包括菌种活化、扩大培养与发酵培养等步骤。本发明通过pH偶联的补料方式和控制不同发酵阶段的溶氧，使固氮螺菌的发酵水平大幅度提高，发酵菌数可达到70-120亿/ml，固氮螺菌活菌数可完全满足制备固氮微生物肥料的要求，本发明的发酵控制方法简单，并易于发酵规模的放大。使用含有本发明固氮螺菌发酵液的微生物肥料增产效果明显，具有广泛的应用前景。

主权项

一种固氮螺菌的发酵方法，其特征在于该方法包括下述步骤：A)菌种活化LB固体培养基的制备：分别称取氯化钠、酵母浸粉、蛋白胨，混合后用蒸馏水或自来水溶解，得到以重量百分数表示的0.8‑1.2％氯化钠、0.4‑0.6％酵母浸粉、0.8‑1.2％蛋白胨，用无机碱或无机酸将该溶液的pH调节至6.8‑7.0，然后加入1.6‑2.4％琼脂粉，再在温度121℃下高压灭菌30分钟后，再放置在室温下静置得到LB固体培养基；把固氮螺菌菌体在所述的LB固体培养基上进行活化，在培养温度28‑32℃下培养至单菌落直径达到2‑3mm；所述的固氮螺菌是深红螺菌或巴西固氮螺菌；B)扩大培养扩大培养的液体培养基的制备：称取下述原料用蒸馏水或自来水溶解，再用无机碱或无机酸将溶液的pH调节至6.8‑7.0，再在温度121℃下高压灭菌30分钟，冷却至室温得到所述的扩大培养的液体培养基：以重量百分数表示，0.12‑2.0％ C2‑C4有机酸、0.05‑0.15％选自氯化铵或硫酸铵的无机铵盐、0.05‑0.3％选自酵母粉、蛋白胨或酶水解酪蛋白的有机氮源、0.02‑0.03％硫酸镁、0.01‑0.1％磷酸盐和0.001‑0.01％选自氯化铁、硼酸、乙二胺四乙酸二钠盐、钼酸钠或柠檬酸铁的微量元素化合物；把步骤A)活化的菌体接入扩大培养的液体培养基中，在温度28‑32℃下振荡培养至对数生长中期；C)发酵培养发酵培养的发酵培养基的制备：称取下述原料用蒸馏水或自来水溶解，再用无机碱或无机酸将溶液的pH调节至6.8‑7.0，再在温度121℃下高压灭菌30分钟，冷却得到所述的发酵培养的液体培养基：以重量百分数表示，0.5‑2.5％ C2‑C4有机酸、0.1‑0.15％选自氯化铵或硫酸铵的无机铵盐、0.1‑0.3％选自酵母粉、蛋白胨或酶水解酪蛋白的有机氮源、0.02‑0.03％硫酸镁、0.01‑0.1％磷酸盐和0.001‑0.01％选自氯化铁、硼酸、乙 二胺四乙酸二钠盐、钼酸钠或柠檬酸铁的微量元素化合物；以所述的发酵培养的液体培养基(以体积计)把3‑10％在步骤B)扩大培养的菌体接入发酵罐中，在发酵温度28‑32℃下进行发酵，并且进行如下控制，直至细胞生长进入对数生长后期，终止发酵，并进行平板稀释涂布计数：(1)在固氮螺菌细胞生长延滞期：将转速控制在100‑300r/min，溶氧控制在0.3‑0.5vvm；(2)在细胞对数生长期：将转速控制在200‑500r/min，溶氧控制在0.5‑0.8vvm；(3)在发酵培养过程中，根据pH变化进行C2‑C4有机酸补料，以便保证在发酵过程中碳源浓度处于恒定水平；所述补料液的C2‑C4有机酸重量百分浓度为20‑90％。