一种肽用于调控奶牛瘤胃发酵的体外应用及检测方法

摘要

本发明提供了一种肽用于调控奶牛瘤胃发酵的体外应用及检测方法，可准确测定肽对瘤胃发酵参数的影响：产气量、pH值、氨态氮值、挥发性脂肪酸和MCP指标是瘤胃发酵的重要指标，对他们的测定可以直接了解活体瘤胃内发酵的具体情况，还可准确测定肽对瘤胃内微生物酶活性的影响：淀粉酶、蛋白水解酶和羧甲基纤维素酶活性是瘤胃内主要的酶活指标，对他们的测定可以直接了解活体瘤胃内微生物的变化情况。本发明方法具有方便易学，操作简便，重复性高，数值准确，模拟逼真性强的特点，能有效地确定奶牛瘤胃内肽适宜的大致浓度。能够为今后更深入的理论研究、更准确的配制奶牛日粮、减少蛋白饲料的浪费，提高奶制品质量做出科学依据和理论指导。

主权项

一种肽用于调控奶牛瘤胃发酵的体外的检测方法，其特征在于它包括以下步骤：(1)人工瘤胃模拟装置：用内径为32mm，长200mm，刻度体积为100ml的医用注射器作为发酵器，用可以精确控温±0.5℃的水浴摇床作为控温装置；(2)人工瘤胃缓冲液的配制：取得瘤胃液以后加入混合培养液：400ml蒸馏水+0.1ml微量元素溶液+200ml缓冲溶液+200ml常量元素溶液+1ml刃天青溶液+40ml还原剂溶液，并混匀，加热至39℃，同时使用CO2饱和；其中微量元素溶液：13.2g CaCl2·2H2O、10.0g MnCl2·4H2O、1.0g CoCl2·6H2O、8.0g FeCl3·6H2O和蒸馏水至100ml；缓冲溶液：4.0g NH4HCO3、35g NaHCO3和蒸馏水至1000ml；常量元素：5.7g Na2HPO4、6.2g KH2PO4、0.6g MgSO4·7H2O和蒸馏水至1000ml；刃天青溶液：0.1％w/v；还原剂溶液：4.0ml NaOH、625.0mg Na2S·9H2O、蒸馏水95ml；每个注射器吸入瘤胃液与缓冲液1∶2混合液共30ml；(3)在瘤胃微生物培养液发酵管中添加肽，各处理组均按氨基氮：淀粉为1∶4.5的比例添加玉米淀粉作为微生物生长能源，每个处理组设发酵2h、4h、6h、8h、12h、24h、48h共七个时间点用于采样，每个时间点设三个重复，每个重复一支发酵管；在各时间点测定发酵管内发酵液的产气量、pH值、氨氮浓度、VFA浓度和MCP的产量；(4)人工瘤胃液的采集：在试验奶牛晨饲2h后，分别从每头牛瘤胃中抽取300ml瘤胃液，混合，用4层精细纱布过滤，灌入到预热达39℃并始终通有CO2的保温瓶中；(5)体外产气量的测定：每个注射器吸入瘤胃液与培养液的混合液后用自制的堵头密封保持厌氧，记录活塞的位置；注射器在39℃水浴，在48小时内读取活塞位置，计数点为2h、4h、6h、8h、24h、48h；用计数点活塞位置减去活塞的初始位置，即为在相应时间内饲料发酵的产气量；(6)瘤胃发酵液pH值的测定：发酵物样品被采集后，采用Sartorius PB‑20型酸度计对发酵物样品进行pH值测定；(7)瘤胃发酵液氨氮浓度的测定：采用试剂均为分析纯，所用水为蒸馏水或去离子水：试剂包括：A液：苯酚显色剂(1L)1)称取0.05g亚硝基铁氰化钠(Na2Fe(CN)5NO·2H2O)溶解于0.5L蒸馏水中；2)称取10g干燥苯酚(C6H5OH)，移入1L的容量瓶中，用蒸馏水定容至1L；3)将上述1L的溶液小心移入棕色瓶内，在2～10℃下避光保存，保质期6个月；B液：次氯酸盐试剂(1L)1)5g氢氧化钠(NaOH)溶于烧杯中，加入600ml蒸馏水；2)37.85g磷酸氢二钠(Na2HPO4·7H2O)适当加热溶解摇匀；3)冷却后，加入100ml次氯酸钠混匀；4)蒸馏水定容至1L；5)1#滤纸过滤后，在2～10℃下，避光保存于聚乙烯瓶中，保质期6个月；氨标准溶液：1)贮备液为32mg/dl；2)1.0045gNH4Cl溶于800ml去氨蒸馏水中；3)用稀释的盐酸滴定至pH值为2；41蒸馏水定容至1L；5)用贮备液配制以下溶液：32，16，8，4，2，1，0mg/dl标准溶液；(8)瘤胃液样品采集：1)用两层精细纱布过滤瘤胃液；2)加入2ml新配制的25％偏磷酸于8ml两层纱布过滤的瘤胃液中，封盖，摇匀；3)若不立即测定在‑20℃保存；4)分析前在11～12,000rpm下离心20min，上清液用于分析；测定步骤：1)漩涡振荡上清液；2)用“Digifiex”自动进样器，吸取40μl瘤胃液或标准液加40μl蒸馏水至贴好标签的试管中，同时设重复；3)吸取A液2.5ml加入每个试管，漩涡振荡；4)吸取B液2.0ml加入每个试管，漩涡振荡；5)在37℃水浴中加热30min；6)550nm下读数；若显色太重，用较小的波长测定，或将样品用蒸馏水1∶1稀释；7)用线性回归估测标准曲线；8)吸收值代入方程，对于瘤胃液NH3‑N，计算结果*1.25校正偏磷酸误差；(9)瘤胃发酵液VFA浓度的测定：试验中所用试剂均为分析纯，所用水为蒸馏水或去离子水；岛津GC‑2010型气相色谱仪，气相色谱条件：柱箱温度120℃、色谱柱为长30m，内径0.22mm，薄膜厚度0.25μm的中极性毛细管柱、SPL230℃、压力97.7kPa、氢气流量40ml/min、空气流量400ml/min、FID240℃；采用外标法，配制一系列已知浓度的色谱标准酸；样品注入量为1μl，即将乙酸400μl，丙酸400μl和丁酸200μl用超纯水定容至100ml，然后用气相色潜仪绘制色谱图，计算各酸的保留时间和峰面积，按单点法将样品测定结果‑峰面积值换算成各挥发性脂肪酸的摩尔浓度(mmol/L)；样品处理：取四层纱布过滤的瘤胃液5mL，10000g离心10min；移取上清液1mL至小离心管中，并加入冰后的25％的偏磷酸0.25mL，静置30min；然后10000g离心15min，取上清液直接进行测定；(10)瘤胃发酵液中微生物蛋白MCP的测定：量取50mL经4层纱布过滤的瘤胃液，于39℃下150g离心5min；准确量取30mL上清液于4℃下20000g离心20min，沉淀加入30mL蒸馏水轻轻摇动溶解后于4℃下20000g离心20min，沉淀经生理盐水和蒸馏水冲洗后再重复加入蒸馏水离心一次，以充分消除饲料氮源后，收集细菌沉淀备用，将上述高速离心收集的细菌沉淀小心无损地转移到消化管中，按凯氏微量定氮法常规测定。