水稻纹枯病菌融合群判定的鉴定方法

摘要

水稻纹枯病菌融合群判定的鉴定方法，属于生物技术领域。其包括对立枯丝核菌8个不同融合群菌株总DNA提取、PCR扩增、rDNA-ITS序列测定、分析等过程的基础上，找到了鉴别立枯丝核菌不同融合群菌株的碱基位点，分别设计出可鉴别不同融合群菌株的高特异性鉴别引物，与通用引物ITS4结合，同时增加通用引物ITS1，利用一步双重PCR方法检测，能得到特异性500bp片段和700bp的DNA片段，成功地进行不同融合群菌株的高特异性PCR鉴别。该发明对为水稻立枯丝核菌的识别提供快速准确的分子检测方法，为制定立枯丝核菌引起的多种病害如纹枯病、立枯病等综合治理决策提供理论参考。

主权项

水稻纹枯病菌融合群判定的鉴定方法，其特征包括以下步骤：1)隶属于不同菌丝融合群AG‑1IA、AG‑1IB、AG‑2‑1、AG‑4、AG‑5、AG‑6、AG‑8和AG‑BI的标准菌株，菌株代号分别为R1～R8，采用改良的CTAB法分别提取其基因组总DNA；2)设计能鉴别水稻纹枯病菌融合群类型的特异性引物：以步骤1)得到的DNA为模板，以ITS1和ITS4为引物，分别进行各个标准菌株的ITS‑5.8S rDNA序列的PCR扩增，扩增后均得到700bp的目的条带，经序列测定后得到不同融合群标准菌株的核苷酸序列，找到区分不同标准菌株的特异性碱基位点，设计出鉴别不同融合群标准菌株ITS‑5.8S rDNA序列的特异性鉴别引物，ITS1核苷酸序列如SEQ No.1所示，ITS4核苷酸序列如SEQ No.2所示，菌丝融合群AG‑1IA标准菌株R1的ITS‑5.8S rDNA序列的特异性鉴别引物，其核苷酸序列如SEQ No.3所示，菌丝融合群AG‑1IB标准菌株R2的ITS‑5.8S rDNA序列的特异性鉴别引物，其核苷酸序列如SEQ No.4所示，菌丝融合群AG‑2‑1标准菌株R3的ITS‑5.8S rDNA序列的特异性鉴别引物，其核苷酸序列如SEQ No.5所示，菌丝融合群AG‑4标准菌株R4的ITS‑5.8S rDNA序列的特异性鉴别引物，其核苷酸序列如SEQ No.6所示，菌丝融合群AG‑5标准菌株R5的ITS‑5.8S rDNA序列的特异性鉴别引物，其核苷酸序列如SEQ No.7所示，菌丝融合群AG‑6标准菌株R6的ITS‑5.8S rDNA序列的特异性鉴别引物， 其核苷酸序列如SEQ No.8所示，菌丝融合群AG‑8标准菌株R7的ITS‑5.8S rDNA序列的特异性鉴别引物，其核苷酸序列如SEQ No.9所示，菌丝融合群AG‑BI标准菌株R8的ITS‑5.8S rDNA序列的特异性鉴别引物，其核苷酸序列如SEQ No.10所示；3)采集表现为水稻纹枯病症状的病株样本，从感病组织中分离、纯化水稻纹枯病菌；4)采用改良的CTAB法提取水稻纹枯病菌的基因组总DNA；5)水稻纹枯病菌融合群判定的双重PCR鉴定：用步骤4)得到的水稻纹枯病菌的DNA为PCR反应模板，以步骤2)得到的不同的融合群的特异性鉴别引物作为水稻纹枯病菌融合群判定的特异性鉴别引物，同时加入通用引物ITS1和通用引物ITS4，分别进行双重PCR，若能同时扩增出500bp和700bp的两条特异性片段，即可判定该水稻纹枯病菌隶属于对应的菌丝融合群；若只能扩增出700bp的片段，即判断水稻纹枯病菌不属于该菌丝融合群；上述的改良的CTAB法步骤如下：取0.2g菌丝，液氮研磨后加入800μL DNA提取液，65℃下水浴保温30min，10000g离心10min；取上清液用等体积的氯仿/异戊醇抽提，10000g离心10min；用氯仿/异戊醇再抽提1次；上清液加入等体积的DNA沉淀液，充分混匀，10000g离心10min；弃上清，在沉淀中加入1M NaCl300μL，重新溶解，再加入等体积的氯仿/异戊醇抽提，10000g离心10min；取上清液加入2.5倍体积的冷冻异丙醇，置于冰上30min沉淀DNA，4℃下10000g离心10min，弃上清液，用70％的酒精清洗2次，抽干后加TE缓冲液充分溶解，即得到菌株的基因组总DNA；上述的DNA提取液为：1L溶液中含有20g CTAB、1.4M NaCl、100mM Tris‑HCl、 20mM EDTA和1mlβ‑巯基乙醇，pH值为8.0；上述的DNA沉淀液为：1L溶液中含有10g CTAB、50mM Tris‑HCl和10mM EDTA，pH值为8.0。