连续发酵生产乳酸链球菌素的方法

摘要

一种连续发酵生产乳酸链球菌素的方法，其特征在于：乳酸链球菌经一级种子、二级种子培养后转移到无菌发酵培养基中，控制发酵过程中的温度、pH，当菌浓度达到一定量后乳酸链球菌素的生物合成被启动，然后不断地从发酵罐中放出发酵液，同时不断的往发酵罐中补充配置好的无菌补料培养基，连续生产工艺可进行7天至15天时间。本发明采用乳酸链球菌的一个亚种（Lactococcuslactis）经两级种子培养，以特定的发酵培养基配方，通过控制向生物反应器中的补料速度、pH、菌浓度并连续或间歇的放出含有乳酸链球菌素的发酵液生产乳酸链球菌素。该方法可有效减少发酵过程中的非最优经济阶段，达到了提高发酵产量，提高设备利用率，降低产品生产成本的目的。

主权项

一种连续发酵生产乳酸链球菌素的方法，其特征在于：乳酸链球菌经一级种子、二级种子培养后转移到无菌发酵培养基中，控制发酵过程中的温度、pH，当菌浓度达到一定量后乳酸链球菌素的生物合成被启动，然后不断地从发酵罐中放出发酵液，同时不断的往发酵罐中补充配置好的无菌补料培养基，连续生产工艺进行7天至15天的时间；具体步骤如下：(1)一级种子培养首先将培养好的乳酸链球菌菌种液接种到灭过菌的种子培养基中，使用的菌种是保藏号为ATCC 11454的乳酸链球菌的一个亚种，在28至33℃培养，培养时间为16至32小时；(2)二级种子培养一级种子培养结束后转移至无菌的二级种子培养基中，在28至33℃培养，培养时间为8至16小时；(3)发酵培养基灭菌一定配比的发酵培养基经120℃，30min灭菌后， pH为6.5至7.5，冷却至28至33℃；所述的发酵培养基的碳源种类为葡萄糖和蔗糖的组合物，两种碳源比例为1：0.5至1：3；总碳源浓度为10克/升至30克/升；所述发酵培养基中氮源种类为酵母提取物、牛肉提取物、鱼粉蛋白水解物、玉米提取蛋白质的水解物的一种或其两种以上的组合物，总氮源浓度为5克/升至25克/升，所用磷酸盐为磷酸氢钾、磷酸氢二钾、磷酸二氢钾的一种或其组合物，总用量5克/升至40克/升；(4)发酵将二级种子转移至发酵罐中，控制发酵温度28至33℃，pH 6.5至7.5，同时每隔2至4小时测定菌浓度、碳源、pH含量；(5)补料培养基灭菌一定配比的补料培养基经120℃，30min灭菌后，pH 6.5至7.5，冷却至28至33℃；所述的补料培养基中含有镁、钙、钾无机元素的盐酸盐、硫酸盐、磷酸盐，使用量分别为0.01克/升至20克/升，碳源种类为葡萄糖和蔗糖的组合物或其中的一种，总碳源浓度为10克/升至30克/升；补料培养基中氮源种类为酵母提取物、牛肉提取物、鱼粉蛋白水解物、玉米提取蛋白质的水解物的一种或其两种以上的组合物，总氮源浓度为10克/升至20克/升，补料培养基中添加B族水溶性维生素的复合物，包括B2、B6、B12，使用量0.5克/升至5克/升；(6)放料、补料发酵罐经16至20小时发酵后，测定菌浓度、碳源含量、乳酸链球菌素含量，当乳酸链球菌素含量达到控制标准后，从发酵罐中放出发酵液，同时往发酵罐中补充经过灭菌的补料培养基，并检测菌浓度、碳源含量、乳酸链球菌素含量、pH，以便控制放料速度和补料速度：所述的放料时乳酸链球菌素浓度标准为7000IU/ml—12000IU/ml，微生物含量达到5克/升至10克/升，用5%至15%氢氧化钠水溶液和1%至2%磷酸盐溶液的一种或两种组合物调节发酵pH为6.5至7.5，所述放料和补料方式是连续同时进行。