一种快速测定海洋双壳贝类总抗氧化能力的方法

摘要

本发明涉及一种测定海洋贝类抗氧化能力的方法，具体说是一种快速测定海洋双壳贝类总抗氧化能力的方法。本发明利用96孔酶标板的全波频扫描型酶标仪代替常规的分光光度计测定处理后样品的总抗氧化能力，能够在极短的时间内，对批量样品进行快速、准确的测定，从而为海产双壳贝类的种间抗性研究提供一个快速检测方法。利用本发明可在极短的时间内批量测定海产双壳贝类不同种类、不同组织的总抗氧化能力，测定速度比常规方法提高10倍左右。

主权项

一种快速测定海洋双壳贝类总抗氧化能力的方法，包括下列步骤：（1）建立Trolox标准曲线：①精确称取Trolox [(±)‑6‑Hydroxy‑2,5,7,8‑ tetramethylchromane‑2‑carboxylic acid]，用95%乙醇配制母液，并稀释成梯度浓度，然后取等量加入不同的试管中再分别加入3倍和30倍的蒸馏水和FRAP工作液（0.3M醋酸盐缓冲液: 10 mM TPTZ溶液: 20 mM FeCl3溶液 = 10: 1: 1比例混合，用前半小时临时配制）建成Trolox反应体系，同时以95%乙醇代替Trolox溶液作为对照；②37℃水浴30 min后，立即以冰水浴终止反应；③然后吸取每份混合物200 μl，用全波频扫描型酶标仪在593 nm处测定其吸光值并计算出标准曲线；（2）建立蛋白质定量标准曲线：①精确称取标准牛血清蛋白，用蒸馏水配制母液，并稀释成梯度浓度，然后取等量加入不同的试管中再加入5倍体积的0.1g/L考马斯亮蓝‑G250染液；②混匀并静置5min，然后吸取每份样品200 μl，用全波频扫描型酶标仪在595 nm处测定其吸光值并计算出标准曲线；（3）组织取样：分别对活的双壳海产贝类的闭壳肌、鳃、外套膜等组织进行取样，并以预冷的生理盐水（0.86％）清洗所取组织样品，整个过程在冰上进行；（4）样品处理：各组织样品初步粉碎并搅拌均匀后，分别称取一定量的组织样品于离心管中，加入体积为样品质量9倍的PBS缓冲液，在冰水浴条件下以10000‑15000 r/min转速进行匀浆，之后以12000 g于4℃下离心10 min，取上清液并稀释到所需的浓度后备用；（5）待测样品Trolox浓度的测定：以待测样品上清液代替步骤1中的Trolox溶液，其余操作同步骤1，然后将吸光值转化为Trolox浓度（μM，C1）；（6）待测样品蛋白质浓度的测定：以待测样品上清液代替步骤2中的标准蛋白质溶液，其余操作同步骤2，然后根据蛋白质定量标准曲线计算出其蛋白质浓度（μg/ml，C2）；（7）样品总抗氧化能力（TAC）的计算：TAC = C1/C2（μmol/mg），即每毫克组织蛋白相当的Trolox的微摩尔数。