固定化酶连续水解白藜芦醇苷制备白藜芦醇的方法

摘要

一种固定化酶连续水解白藜芦醇苷制备白藜芦醇的方法，涉及白藜芦醇的制备方法。本发明以市售的赖氨酸修饰的壳聚糖微球阴离子交换树脂、β-葡萄糖苷酶、白藜芦醇苷和XAD-7HP大孔吸附树脂为原料，先制备固定化β-葡萄糖苷酶，后装柱成柱式酶反应器，再经连续水解、吸附、洗脱、结晶而得产品。本发明生产过程的工艺，设备及操作简单；反应条件温和，节约能源；在生产过程中的物料都采用循环处理回收利用或再生反复使用，无废物排放，有利于环境保护；生产成本低，便于推广应用，有利于可持续发展。本发明可广泛应用于制备白藜芦醇，采用本发明方法制备出的产品，可广泛应用于医药、食品处理、化妆品等行业中。

主权项

一种固定化酶连续水解白藜芦醇苷制备白藜芦醇的方法，其特征在于所述方法的具体步骤如下：(1)配制β‑葡萄糖苷酶缓冲溶液以市售的β‑葡萄糖苷酶为原料，按照β‑葡萄糖苷酶的质量∶缓冲溶液体积比为1mg∶0.5～1.5L的比例，将β‑葡萄糖苷酶加入缓冲溶液中，搅拌混合均匀，其中，所述的缓冲溶液为pH值6.0～8.0的磷酸氢二钠‑柠檬酸缓冲溶液；(2)制备固定化β‑葡萄糖苷酶第(1)步完成后，以市售的赖氨酸修饰的壳聚糖微球阴离子交换树为原料，按照赖氨酸修饰的壳聚糖微球阴离子交换树脂的质量∶第(1)步制备出的β‑葡萄糖苷酶缓冲溶液的体积∶1％的戊二醛溶液的体积比为1g∶10～20mL∶1～3mL的比例，先将赖氨酸修饰的壳聚糖微球阳离子交换树脂加入到β‑葡萄糖苷酶缓冲溶液中，搅拌吸附1～3小时后再加入戊二醛溶液，反应1～3小时后将反应产物放置于真空过滤器中，进行真空过滤，分别收集滤液和滤渣，对于收集的滤渣，按照滤渣的质量∶缓冲溶液体积之比为1g∶10～50mL的比例，用缓冲溶液对滤渣进行洗涤，分别收集洗涤液和洗涤后的滤渣，再按洗涤后的滤渣的质量∶缓冲溶液的体积之比为1g∶10～50mL的比例，再用缓冲溶液对洗涤后的滤渣进行洗涤，分别收集洗涤液和洗涤后的滤渣，如此重复，直至洗涤液中检测不出酶蛋白质为止，最后合并各次收集的洗涤液和第(2)步收集的滤液，所述的缓冲溶液为pH值6.0～8.0的磷酸氢二钠‑柠檬酸缓冲溶液；(3)制备白藜芦醇苷水解液第(2)步完成后，以市售的白藜芦醇苷为原料，先将第(2)步制得的固定化β‑葡萄糖苷酶装入夹套保温层析柱中，升温至30～60℃，再按照市售的白藜芦醇苷的质量∶乙醇体积浓度为30～50％的乙醇溶液体积之比为1g∶0.5～1.5L的比例，将市售的白藜芦醇苷加入到乙醇溶液中，搅拌至溶解，然后，将制得的白藜芦醇苷溶液泵入到组装的固定化β‑葡萄糖苷酶柱式反应器中，控制白藜芦醇苷溶液的泵入速度为固定化β‑葡萄糖苷酶柱式反应器体积mL的2～6倍/小时，进行连续水解反应26～40小时，分别收集固定化β‑葡萄糖苷酶柱式反应器的流出液和固定化β‑葡萄糖苷酶柱式反应器；(4)再生固定化β‑葡萄糖苷酶柱式反应器第(3)步完成后，向第(3)步收集的固定化β‑葡萄糖苷酶柱式反应器中，泵入纯净水进行清洗，控制纯净水泵入速度为固定化β‑葡萄糖苷酶柱式反应器体积mL的2～6倍/小时，直至清洗液中无白藜芦醇苷和白黎芦醇时止，分别收集清洗液和清洗后的固定化β‑葡萄糖苷酶柱式反应器；(5)制备白藜芦醇晶体第(4)步完成后，以市售的活化的XAD‑7HP大孔吸附树脂为原料，先将市售活化的XAD‑7HP大孔吸附树脂装入中压层析柱中，先泵入第(3)步收集的白藜芦醇苷水解液，控制白藜芦醇苷水解液泵入速度为XAD‑7HP大孔吸附树脂柱体积的2～6倍/小时，直至流出液中出现白藜芦醇为止，分别收集流出液和吸附白藜芦醇的XAD‑7HP大孔吸附树脂柱，再将收集的吸附白藜芦醇的XAD‑7HP大孔吸附树脂柱泵入等树脂柱体积的蒸馏水进行洗涤，分别收集洗涤液及洗涤后的吸附有白藜芦醇的XAD‑7HP大孔吸附树脂柱，对于收集的洗涤后吸附有白藜芦醇的XAD‑7HP大孔吸附树脂柱，按照XAD‑7HP大孔吸附树脂质量∶乙醇体积浓度为50～90％的乙醇溶液体积之比为1g∶40～80mL的比例，向洗涤后的吸附白藜芦醇的XAD‑7HP大孔吸附树脂柱泵入流速为2～6倍树脂体积/小时的乙醇溶液，分别收集洗脱流出液和洗脱吸附有白藜芦醇的XAD‑7HP大孔吸附树脂，然后合并洗脱流出液和再生XAD‑7HP大孔吸附树脂的洗涤液，并将该合并液泵入真空浓缩器中，在真空度为‑0.6～‑0.9MPa，温度为75～90℃下，进行真空浓缩，直至浓缩液中无乙醇气味时为止，分别收集白藜芦醇浓缩液和蒸发液，最后将收集的白藜芦醇浓缩液，泵入结晶罐中，进行结晶24～36小时，结晶完成后，进行过滤，分别收集滤渣和滤液，对于收集的晶体，置于真空烘箱中，于60‑80℃干燥2‑3小时，就制备出纯度高达98‑99％的白藜芦醇晶体产品。