核酸内切酶DUF820-1的原核表达与制备方法及应用

摘要

核酸内切酶DUF820-1的原核表达与制备方法及应用，涉及核酸内切酶。从蓝藻Microcystis aeruginosa PCC7806染色体DNA上PCR扩增出DUF820-1基因，将其克隆到表达载体pET-His中，将构建成功的重组质粒pET-DUF820-1转化大肠杆菌，实现DUF820-1在大肠杆菌中的大量诱导表达。将诱导表达菌超声破碎后用Ni-NTA琼脂糖树脂纯化可得DUF820-1蛋白。DNA酶切实验表明，表达纯化的DUF820-1蛋白具有核酸内切酶的活性，在合适的反应缓冲液中能酶切环状质粒DNA和染色体DNA。该酶在30～64℃温度内具有核酸内切酶活性，其最适反应温度为61℃。

主权项

核酸内切酶DUF820‑1基因的克隆和表达载体的构建方法，其特征在于包括以下步骤：1)根据核酸内切酶的保守基序对铜绿微囊藻Microcystis aeruginosa PCC7806基因组序列进行保守结构域扫描，寻找具有核酸内切酶保守基序的蛋白，并对具有核酸内切酶保守基序的蛋白的序列进行分析；得到属于DUF820超家族的3个功能未知蛋白具有核酸内切酶的保守结构域，将这3个蛋白分别命名为DUF820‑1、DUF820‑2和DUF820‑3；所述DUF820‑1蛋白含194个氨基酸，分子量为22.84KD，在GenBank中的登陆号为CAO87581.1，其编码基因的登陆号为AM778948.1，基因位置标签为IPF_2243，其基因序列见附录序列表中第1个序列，氨基酸序列见附录序列表中第2个序列；2)DUF820‑1基因的扩增，具体方法如下：根据DUF820‑1的基因序列设计合成如下两条引物P1和P2：P1：5’‑CCGGATCC CATATGCTAACTCGATCTCC‑3’P2：5’‑CCGAATTCTTAGGATTTGAGATTAAAATC‑3’以铜绿微囊藻Microcystis aeruginosa PCC 7806的染色体DNA为模板，P1和P2为引物进行PCR扩增，取扩增产物进行0.8％琼脂糖凝胶电泳检测，结果表明，扩增产物大小为580bp左右，与预期大小相吻合；3)表达载体pET‑DUF820‑1的构建，具体方法如下：将载体pET‑His和步骤2)中的扩增产物分别用BamH I和EcoR I双酶切，酶切产物经0.8％琼脂糖凝胶电泳后切胶回收，然后将回收产物用T4DNA连接酶连接，连接产物转化大肠杆菌，以Amp抗性筛选，获得重组载体pET‑DUF820‑1。