一种基于土臭素关键合成酶的荧光定量PCR方法

摘要

一种基于土臭素关键合成酶的荧光定量PCR方法，属于生物检测技术领域。本发明设计扩增引物序列245F/551R，荧光定量PCR鉴别检测方法的步骤为：（1）提取总DNA模板，（2）在PCR反应管中配置反应体系，（3）PCR反应，（4）检测融解温度曲线，（5）结果分析，报告检测样品为阳性或阴性。采用PCR法扩增目的基因，实时检测反应体系的荧光强度，并根据分析软件计算Ct值并计算出样品geosmin编码基因的含量；同时，不同菌株具有型特异性融解温度，能实现不同基因型的鉴别检测。本发明保留了PCR方法的高灵敏度、高准确度的特点，荧光定量PCR提高了检测效率，降低了检测成本，同时实现鉴别诊断的目的，为可疑污染源调查、传播环境、产生菌溯源等工作奠定基础。

主权项

一种基于土臭素geosmin关键合成酶编码基因的荧光定量PCR方法，其特征在于根据已报道的保藏菌株中geosmin关键合成酶geoA的高度保守序列设计一对保守扩增引物，并调取上述菌株中geosmin关键合成酶编码基因；所述的扩增引物序列为：245F：5’‑TCTTCTTCGACGACCACTTCCT‑3’，551R：5’‑CGGCGCATCTCGATGTACTC‑3’； 荧光定量PCR鉴别检测方法的步骤如下：（1）提取总DNA模板：将待测样品大曲或酒醅采用Hoffman报道的方式提取基因组提取总DNA，最后加入30 μL无菌重蒸水融解；另设阳性对照为添加含有geoA的产geosmin菌株的样品；阴性对照为无菌生理盐水；所述保藏菌株，即产土臭素geosmin的菌株，共四株，分别为：①分类命名为白色链霉菌（Streptomyces albus）LBG‑FXJ，已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号CGMCC No. 4206；②分类命名为弗氏链霉菌（Streptomyces fradiae）FJ‑HX，已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号CGMCC No. 4205；③分类命名为链霉菌（Streptomyces sp.）QC‑1，已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号CGMCC No. 4535；④分类命名为链霉菌（Streptomyces sp.）QC‑2，已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号CGMCC No. 4536；该四株菌株已申请中国专利，申请号201110087614.4，公开号CN102181392A，公开日2011年9月14日；（2）在PCR反应管中配置反应体系：以提取的总DNA为模板，体系的总体积为20μL，其组成如下：10μL荧光定量2×SsoFast EvaGreen supermix（bio‑radTM），分别添加浓度为25 μM双向引物245F及551R 各1μL，模板1μL，双蒸水补至20μL；（3）PCR反应：将PCR反应管置于荧光定量PCR仪中，反应条件如下：第一阶段：98℃，2min；第二阶段：98℃，5s；第三阶段：56℃，5s，第二阶段和第三阶段共同操作40个PCR循环，并于每次循环中的第三阶段同时采集荧光信号，绘制扩增曲线；（4）检测融解温度曲线：40个PCR循环结束后，在72~96℃区间检测融解温度曲线，全过程进行荧光信号的检测，检测间隔为每0.3℃，检测持续时间为0.5s；（5）结果分析：阴性对照Ct值应显示为0或≥40.0，阳性对照的Ct值应显示0＜Ct≤30.0，否则视实验失败，需重做；检测样品Ct值显示，0＜Ct≤35.0，结果有效，直接报告样品阳性；检测样品35.0＜Ct值＜40.0，需进行一次重复实验，若Ct值仍介于35.0和40.0之间，且曲线有明显的指数增长特性，同时阴性对照Ct值为零，报告样品阳性；若重复实验结果的Ct值仍介于35.0和40.0之间，且曲线有明显的指数增长特性，同时阴性对照Ct值不为零，报告样品阴性；检测样品Ct值为零，报告样品阴性。