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一种从淡水沉积物中提取总DNA的方法，其特征在于包括下列步骤：1)称取新鲜淡水沉积物0.3g于2ml的无菌离心管中，加300μlpH为6.6磷酸缓冲液，再往其中加400μl溶液A，在微型涡旋混合仪上涡旋2‑3分钟，使沉积物与溶液混匀，再往该离心管中加40μl沉积物预处理液B，涡旋1min，于室温在12000g下离心5min，弃上清；2)向步骤1)中的离心管中添加630μl溶液C和70μl溶液D，10μl 10mg/ml的蛋白酶K，涡旋5分钟，得到沉积物悬浮物；3)将步骤2)的沉积物悬浮物在37℃下水浴1h，再加100μl 20％的十二烷基硫酸钠，于65℃水浴2h，期间每隔10‑15min颠倒一次离心管；4)将步骤3)的离心管于10000g下离心5min，取上清700μl于一1.5ml离心管中，加入700μl溶液E，充分混匀，于室温10000g下离心5min，取600μl上清于另一1.5ml离心管中，再加入500μl溶液E，充分混匀，室温10000g离心10min，得上清；5)取450μl步骤(4)的上清至1.5ml离心管中，加入45μl溶液F和250μl溶液G，混匀，于室温下放置1h，然后在10000g下离心10min，弃上清，留沉淀物1；6)向步骤5)的沉淀物1中加入500μl 80％的乙醇，于12000g下离心10min，弃上清，重复该步骤，得沉淀物2；7)将步骤6)沉淀2在5000g离心1s，用微量移液器将离心管中残留的液体除去，于室温下干燥10min，得沉积物总DNA；8)向步骤7)的沉积物总DNA中添加50μl超纯水，使该沉积物总DNA溶解，在紫外分光光度计上检测该沉积物DNA的浓度和纯度；9)用步骤8)得到的DNA，以16S rDNA的特异引物341F：5’CCTACGGGAGGCAGCAG 3’和534R：5’ATTACCGCGGCTGCTGGCA 3’为引物进行PCR，扩增得到沉积物16S rDNA序列片段，其中：步骤1)中的溶液A为200mM的明矾溶液；沉积物预处理液B为20％浓度的NaOH溶液；步骤2)中的溶液C的配方为：100mM Tris‑Hcl；100mM EDTA；10mM pH为8.0的磷酸盐，1.5M NaCl及1％CTAB溶液；溶液D为100mM的焦磷酸钠溶液。步骤5)中的溶液E配方为：饱和酚、三氯甲烷和异戊醇，其体积比为25∶24∶1。步骤6)中的溶液F为5M的NaCl溶液；溶液G为50％的聚乙二醇6000溶液。 |
