一种重组胸腺素β4二串体蛋白的制备方法

摘要

重组胸腺素β4二串体蛋白及其制备方法，通过合成人胸腺素β4全长cDNA结合PCR技术，构建了人胸腺素β4二串体基因表达载体pET-22b(+)-Tβ4②，使无法在大肠杆菌中直接表达的人胸腺素β4以二串体的形式在大肠杆菌中高效表达，并且纯化的人胸腺素β4二串体蛋白具有生物学活性，可以促进小鼠淋巴细胞增殖，并且免疫原性低，为人胸腺素β4的进一步研究和广泛应用奠定基础。

主权项

一种重组胸腺素β4二串体蛋白的制备方法，其特征在于，其制备方法按照以下步骤：1)构建胸腺素β4二串体基因表达载体或重组质粒pET‑22b(+)‑Tβ4②a)pET‑22b(+)‑Tβ4①的构建依据大肠杆菌偏爱的密码子，将胸腺素β4的氨基酸序列转化为cDNA序列，5’端引入Nde I酶切位点，3’端引入BamH I酶切位点，设计的基因序列如下：catatgagtg ataaaccgga tatggccgag attgagaaat ttgataagtc aaaattgaagaaaacggaaa ctcaggaaaa gaacccgttg ccttcaaaag agaccatcga acaggaaaagcaggcggggg aaagcggatc c，人工合成上述基因并将其克隆入表达载体pET‑22b(+)Nde I、BamH I酶切位点之间，得到重组质粒pET‑22b(+)‑Tβ4①；b)pET‑22b(+)‑Tβ4②的构建通过PCR将步骤a)所述的胸腺素β4基因两端的酶切位点Nde I、BamH I突变成BamH I和Sal I，并引入终止密码子TAG，设计PCR引物如下：F：cgcggatcca gtgataaacc ggatatggcR：gacgtcgacc tagctttccc ccgcctgctt ttccPCR反应的循环参数：95℃预变性5min后，按下列参数循环30次：94℃变性30s，65℃退火30s，72℃延伸1min，最后再于72℃延伸10min；收集PCR退火产物；用BamH I和Sal I双酶切位点将PCR退火产物克隆入pET‑22b(+)‑Tβ4①，构建成重组质粒pET‑22b(+)‑Tβ4②，重组质粒转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，提取质粒，经酶切鉴定获导预期大小的插入片段，两个胸腺素β4基因在的重组质粒连接方式为Nde I酶切位点‑Tβ4基因‑BamH I酶切位点‑Tβ4基因‑TAG‑SalI 酶切位点，其核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示；2)胸腺素β4二串体蛋白的纯化a)用重组质粒pET‑22b(+)‑Tβ4②转化大肠杆菌BL21感受态细胞，0.01mM IPTG诱导4h后收集菌体，按1g菌体加10ml裂菌STE缓冲液的比例将菌体重悬，所述的STE缓冲液：20mM Tris‑HCl pH 7.5，100mM NaCl，1mM EDTA；在冰浴中超声裂解菌体，4℃条件下离心12000rpm×20min，收集上清液，加(NH4)2SO4至饱和度为60％，4℃静置1h；4℃条件下离心12000rpm×20min，收集上清；b)上清液顺次用A液充分平衡的疏水柱层析纯化；用B液连续梯度洗脱10个柱床体积，收集目的蛋白胸腺素β4二串体蛋白所在洗脱峰的洗脱液，用50倍洗脱峰体积的C液透析，中间换C液三到四次；透析后用C液充分平衡的阴离子交换柱层析纯化，用D液连续梯度洗脱10个柱床体积，收集目的蛋白所在洗脱峰的洗脱液，用50倍洗脱峰体积磷酸盐缓冲液PBS透析，用0.22μm滤膜过滤除菌，得到纯化的胸腺素β4二串体蛋白；所述的A液：20mM Tris‑HCl pH 7.5，60％(NH4)2SO4，1mM EDTA，B液：20mMTris‑HCl pH 7.5，1mMEDTA，C液：20mMTris‑HCl pH 7.0，1mMEDTA，D液：20mM Tris‑HCl pH 7.0，1M NaCl，1mM EDTA。