一种体外诱导、分化胚胎干细胞的方法

摘要

本发明属生物技术领域，涉及一种诱导分化细胞的方法。具体涉及一种胚胎干细胞体外诱导分化为肝细胞的方法。更具体地，本发明涉及小鼠胚胎干细胞体外经细胞因子和丁酸钠联合诱导高效分化为肝细胞的新方法。本发明方法经试验结果显示，其分化效率高达74％，分化效率高于现有技术文献报道的单纯以细胞因子为主或单纯以丁酸钠的诱导方法。

主权项

一种体外诱导、分化胚胎干细胞的方法，其特征是采用细胞因子与丁酸钠联合诱导小鼠ES细胞向肝细胞分化，包括下述步骤：1)ES细胞体外培养：采用Es细胞培养基：无饲养层高糖DMEM培养基，其中添加10％胎牛血清、10U/L白血病抑制因子(LIF)、0.1mmol/L β‑巯基乙醇、1mmol/L谷氨酰胺和非必需氨基酸，ES细胞复苏后于明胶预处理的6孔板中贴壁培养，每1‑2d用0.25％胰酶消化并传代；2)诱导ESC向肝细胞分化：首先培养液中加50‑150ng/ml人ActivinA的去除LIF的上述培养液培养3天得限制性内胚层细胞，然后在培养液中加20‑40ng/ml人aFGF，与2‑3mM丁酸钠联合诱导5天以向肝细胞方向分化，再加入20‑60ng/mlHGF诱导因子继续诱导成熟培养5天，最后以10‑30ng/mlOSM；0.1‑0.4μM Dex继续培养成熟肝细胞5天；3)肝细胞标志检测包括观察分化细胞的形态，免疫荧光检测白蛋白、甲胎蛋白和细胞角蛋白18的表达，检测特异基因mRNA的表达，肝细胞功能检测及肝细胞分化效率的检测。