超声波辅助花粉介导植物转基因方法

摘要

一种改良的超声波辅助花粉介导植物转基因方法，目的目的是显著提高超声波处理花粉授粉后植株的结实率，进而提高每次处理获得的转化体数；本发明方法以携带外源基因片段的农杆菌Ti质粒、大肠杆菌质粒或其它DNA载体为基因供体，以植物花粉为受体，在经过通气和低温处理的5—50%的蔗糖溶液中使花粉与外源DNA混合，通过超声波辅助作用使外源基因转移到受体花粉中；然后将处理花粉授到植物柱头上，并在籽粒成熟时予以收获；在随后的生长季将转化处理花粉授粉后收获的种子播种，并通过对萌发种子和幼苗的筛选，对成苗株样本DNA的PCR扩增及Southern杂交，进一步确定转化株。本发明方法不需进行组织培养，没有物种及基因型依赖性，能缩短转基因育种年限并节省人力和物力。

主权项

一种超声波辅助花粉介导植物转基因方法，其特征是以携带外源基因片段的农杆菌Ti质粒、大肠杆菌质粒或其它DNA载体为基因供体，以植物的雄配子体花粉为受体，在经过通气和低温处理的浓度为5—40%的蔗糖溶液中使花粉与DNA片段混合，通过超声波辅助作用使外源基因转移到受体花粉中；然后将花粉悬浮液略微静置后倒掉上清液，花粉在蔗糖溶液中的浸泡时间越短越好，在28℃且未做通气处理的悬浮液中浸泡最长不超过1小时；用细刷将沉淀的处理花粉授到植物柱头上，并在籽粒成熟时予以收获；在随后的生长季将转化处理花粉授粉后收获的种子播种，通过对萌发种子和幼苗的筛选，对成苗株样本DNA的PCR扩增及Southern杂交，进一步确定转化株；在加入花粉和外源DNA片段前对蔗糖溶液进行通气和低温处理，使用空气泵给蔗糖溶液连续通气20分钟以上，使蔗糖溶液中的空气含量达到饱和状态，同时将蔗糖溶液置于0—4℃冰浴或冰箱中预处理；加入花粉和外源DNA片段后，形成花粉悬浮液，并在以后的操作过程中始终将该花粉悬浮液置于0—4℃冰浴中；花粉在0—4℃低温干燥条件下保存以及在2—48小时之间使用均有利于保持花粉活力。