一种制备重组人生长激素的方法

摘要

本发明涉及基因重组技术领域，具体为一种制备制备重组人生长激素的方法，解决现有利用大肠杆菌表达重组人生长激素的方法均存在各自不同的缺点以及得到的人生长激素活性低、纯度低等问题，包括构建人生长激素基因克隆，并替换掉大肠杆菌不利表达的密码子获得优化的基因序列，再加入PDI的分子伴侣帮助目的基因在大肠杆菌中高效表达，在序列中内嵌入HIS标签和蛋白酶切位点帮助目的蛋白高效提纯，最后利用Factor Xa蛋白酶去除HIS标签，露出其本来的氨基端，这样进入人体后不会产生抗体，得到的人生长激素产品纯度高，产量高，成本低，生产工艺简单，产品质量稳定。

主权项

一种制备重组人生长激素的方法，其特征是包括以下步骤：(1)根据人生长激素HGH全长序列设计引物，并替换掉大肠杆菌不利表达的密码子以获得优化的基因序列nHGH，然后在nHGH基因序列的5`末端依次增加两段基因序列，分别为Factor Xa蛋白酶切位点序列FX和HIS标签序列HIS6，得到表达基因片断HIS6‑FX‑nHGH；接着再将分子伴侣PDI的全长基因序列克隆出来并在其3`末端加入Prescission Protease蛋白酶切位点序列pp，构建得到PDI‑pp，然后将其连接到基因片断HIS6‑FX‑nHGH的5`末端，最后一起克隆进入pET‑21b  载体，即重组为表达载体pET‑21b‑PDI‑pp‑HIS6‑FX‑nHGH，相应表达出的重组蛋白为PDI‑pp‑HIS6‑FX‑nHGH；(2)将步骤(1)中构建好的表达载体pET‑21b‑PDI‑pp‑HIS6‑FX‑nHGH转化至大肠杆菌ORIGAMI，用IPTG储液诱导重组基因的表达，离心收集菌体；同时将含有Prescission Protease的质粒转入Rosseta菌株，同样用IPTG储液诱导表达，离心收集菌体；然后将两种菌体混合在一起；(3)用Tris缓冲液重悬得到的菌体，超声破碎，离心收集上清液；调整PH值为7.0‑8.0，低温振荡使Prescission Protease将重组蛋白酶切完全，释放出中间阶段的HIS6‑FX‑nHGH蛋白，得到含有人生长激素的溶液；(4)将含有人生长激素的溶液进行纯化处理，得到含有人生长激素的精品；nHGH的核苷酸序列为：ttcccgacta ttccactgtc tcgtctgttc gataatgcaa tgctgcgtgc gcgtcgtctg     60taccagctgg cgtacgacac gtatcaggag ttcgaggaag catatatcct gaaagaacag    120aaatattctt tcctgcagaa cccgcagacc tccctgtgct tcagcgaatc tatccctacc    180ccgtctaacc gcgttaaaac ccaacagaaa agcaatctgg aactgctgcg tatctccctg    240ctgctgatcc agagctggct ggaaccggta caactgctgc gctccgtgtt tgctaacagc    300ctggtatatg gcgcctccga ttccaacgtt taccgccatc tgaaagacct ggaagaaggt    360ctggtatatg gcgcctccga ttccaacgtt taccgccatc tgaaagacct ggaagaaggt    420cagtcttact ccaaatttga cactaagtct cacaacgacg atgctctgct gaaaaactac    480ggcctgctgt actgtttccg taaagatatg gacaaggtcg aaaccttcct gcgtattgtt    540cagtgtcgta gcgtggaagg ttcctgcggt ttc                                 573；针对nHGH序列设计全套引物，全部从5`‑3`排列如下所示：nHGHs‑FX(P1)：ATCGAAGGTCGTTTCCCAACCATTCCCTTATCCnHGHs‑HIS‑FX(P2)：CCAT AGATCTGCACCACCACCATCATCAC                  ATCGAAGGTCGTTTCCnHGHa(P3)：CCG GAATTC TTATCA GAAACCGCAGGAACCTTCC；PDI的核苷酸序列为：atgctgcgcc gcgctctgct gtgcctgccg tggcccgccc tggtgcgcgc cgacgccccc    60gaggaggagg accacgtctt ggtgctgcgg aaaagcaact tcgcggaggc gctggcggcc   120cacaagtacc cgccggtgga gttccatgcc ccctggtgtg gccactgcaa ggctctggcc   180cctgagtatg ccaaagccgc tgggaagctg aaggcagaag gttccgagat caggttggcc   240aaggtggacg ccacggagga gtctgaccta gcccagcagt acggcgtgcg cggctatccc   300accatcaagt tcttcaggaa tggagacacg gcttccccca aggaatatac agctggcaga   360gaggctgatg acatcgtgaa ctggctgaag aagcgcacgg gcccggctgc caccaccctg   420cctgacggcg cagctgcaga gtccttggtg gagtccagcg aggtggccgt catcggcttc    480ttcaaggacg tggagtcgga ctctgccaag cagtttttgc aggcagcaga ggccatcgat    540gacataccat ttgggatcac ttccaacagt gacgtgttct ccaaatacca gctcgacaaa    600gatggggttg tcctctttaa gaagtttgat gaaggccgga acaactttga aggggaggtc    660accaaggaga acctgctgga ctttatcaaa cacaaccagc tgccccttgt catcgagttc    720accgagcaga cagccccgaa gatttttgga ggtgaaatca agactcacat cctgctgttc    780ttgcccaaga gtgtgtctga ctatgacggc aaactgagca acttcaaaac agcagccgag    840agcttcaagg gcaagatcct gttcatcttc atcgacagcg accacaccga caaccagcgc    900atcctcgagt tctttggcct gaagaaggaa gagtgcccgg ccgtgcgcct catcaccttg    960gaggaggagatgaccaagta  caagcccgaa tcggaggagc tgacggcaga gaggatcaca    1020gagttctgcc accgcttcct ggagggcaaa atcaagcccc acctgatgag ccaggagctg    1080ccggaggact gggacaagca gcctgtcaag gtgcttgttg ggaagaactt tgaagacgtg    1140gcttttgatg agaaaaaaaa cgtctttgtg gagttctatg ccccatggtg tggtcactgc    1200aaacagttgg ctcccatttg ggataaactg ggagagacgt acaaggacca tgagaacatc    1260gtcatcgcca agatggactc gactgccaac gaggtggagg ccgtcaaagt gcacggcttc    1320cccacactcg ggttctttcc tgccagtgcc gacaggacgg tcattgatta caacggggaa    1380cgcacgctgg atggttttaa gaaattccta gagagcggtg gccaagatgg ggcaggggat    1440gttgacgacc tcgaggacct cgaagaagca gaggagccag acatggagga agacgatgac    1500cagaaagctgtgaaagatgaactgtaa                                          1527。