用荧光标记核苷酸反转录检测菌体RNA转录水平的方法

摘要

本发明公开一种生物工程技术领域的用荧光标记核苷酸反转录检测菌体RNA转录水平的方法，步骤为：根据菌体目的基因序列设计并合成上游引物，提取总RNA后，运用反转录酶将荧光标记核苷酸整合到cDNA中，通过异丙醇沉淀得到DNA，并用乙醇洗涤游离荧光标记核苷酸，以使DNA信号测定准确，用荧光分析仪测定荧光信号。本发明方法新颖，与其他运用荧光标记探针测定菌体转录水平的方法相比，步骤简单，节约时间，不需要复杂的仪器。

主权项

一种用荧光标记核苷酸反转录检测菌体RNA转录水平的方法，其特征在于，包括如下步骤：第一步，反转录引物设计：根据所测目的基因具体序列，设计上游引物用于RNA的反转录；第二步，提取菌体RNA，用OD260/280和琼脂糖电泳检查RNA的纯度和完整性；第三步，荧光标记和荧光信号检测：①在DEPC处理过的PCR管中依次加入菌体RNA，反转录引物，dATP、dTTP、dGTP、dCTP，DEPC水；②PCR仪中65℃保温5～10min，取出后迅速置于冰上冷却；③向PCR管中依次加入反转录缓冲液及其反转录酶，荧光标记核苷酸；④42～45℃保温60～120min；⑤94～98℃终止反应，⑥加入氢氧化钠，混匀，60～80℃保温5min；⑦12,000rpm，离心10min，取上清；⑧醋酸中和，加入异丙醇，混匀，沉淀30min；⑨12,000rpm，离心10min，用乙醇洗涤沉淀；⑩无菌水溶解沉淀，用荧光分析仪测定荧光信号。