一种从克氏原螯虾虾壳中提取DNA的方法

摘要

本发明属于水产动物分子生物学DNA样品制备技术领域，具体涉及一种从克氏原螯虾虾壳中提取DNA的方法。其步骤为：将浸泡在乙醇溶液中的克氏原螯虾虾壳剪碎，向离心管中加入适量组织裂解液、EDTA、二硫苏糖醇和蛋白酶K等，经水浴裂解、乙酸铵抽提等步骤，得到克氏原螯虾总DNA。本发明具有操作简单、方便，所用试剂毒性较小，样本取样时对实验动物伤害小，样本易长期保存，且提取的DNA降解程度比从虾尾肌中提取的DNA降解程度低。本发明制备的DNA可以用于克氏原螯虾种群遗传多样性分析及相关分子生物学应用。

主权项

一种从克氏原螯虾的虾壳中提取DNA的方法，其特征包括以下步骤：1)取克氏原螯虾虾壳50mg，用滤纸吸干后置入2ml的离心管中，用剪刀将虾壳剪碎；2)向步骤1)的离心管中加入500μL的组织裂解液，0.5M的EDTA60μL，1M的二硫苏糖醇40μL和20mg/mL的蛋白酶K 10μL，于65℃下水浴4‑5h，期间每隔0.5～1h摇匀一次，得到样品1；3)将步骤2)的样品1取出置冰上冷却后，加入7.5M的乙酸铵200μL，充分混匀，冰上冷却5min，得到样品2；4)将步骤3)的样品2用冷冻离心机于4℃，12000rpm，离心10min后，吸取上清液移入另一离心管中，重复步骤3)，得到样品3；5)用冷冻离心机将步骤4)中的样品3于4℃，12000rpm下离心10min后，取上清液移入另一离心管中，按体积比加入1～1.5倍的异丙醇，轻轻摇动1～2min，得到样品4；6)采用冷冻离心机将步骤5)中的样品4于4℃，12000rpm下离心10min后，弃去上清，得DNA沉淀样品1；7)将步骤6)中的沉淀加入浓度为70％的乙醇1mL进行洗涤，用冷冻离心机于4℃下12000rpm，离心10min后弃去上清，得到DNA沉淀样品2；8)将步骤7)中的沉淀加入无水乙醇1mL进行洗涤，用冷冻离心机于4℃下12000rpm，离心10min后弃去上清，得到DNA沉淀样品3；9)将步骤8)的DNA沉淀样品3于室温置于敞开的离心管内，待乙醇挥发干净后，加入20‑40μL灭菌双蒸水，置于4℃冰箱12‑24h直至DNA样品完全溶解，得到克氏原螯虾总DNA溶液。其中步骤2)所述的组织细胞裂解液组分如下：100mM Tris‑HCl，pH 8.0；50mM EDTA，pH 8.0；1％十二烷基硫酸钠。