可定向克隆启动子并研究其活性的T载体及其构建方法

摘要

本发明公开了一种可直接定向克隆启动子并研究启动子活性的T载体及其构建方法，包括以下步骤：1)制备含有XcmI盒(或AhdI盒)的前T载体，包括间隔DNA序列即带有与出发载体具有不同抗性基因或其它选择标记的序列，紧密连接于此间隔DNA序列两侧的各一个XcmI酶切位点序列；2)用XcmI酶或XcmI酶同裂酶酶切步骤1)中的前T载体，得到T载体；其中所述步骤1)中的XcmI盒通过PCR扩增得到，在上游引物XcmI酶识别位点中尚包含稀有限制酶PmeI识别位点的前半部分，用于启动子PCR产物的定向克隆分析。本发明中的方法同样适用于普通克隆型T载体和表达型T载体的制备，将在基因工程领域中发挥重要作用。

主权项

1.一种用于克隆启动子的T载体pEGFP-T、pGL3-T和pSEAP2-T的制备方法，包括以下步骤：1)制备含有XcmI盒的前T载体pEGFP-UC、pGL3-UC和pSEAP2-UC，所述XcmI盒包括间隔DNA序列和紧密连接于所述间隔DNA序列两侧的各一个XcmI酶切位点序列；所述XcmI盒还包括连接于所述各一个XcmI位点的酶切位点序列，即用于前T载体pEGFP-UC制备的BglII和XhoI识别位点或用于前T载体pGL3-UC与pSEAP2-UC制备的MluI和XhoI位点，在出发载体pEGFP-1的多克隆位点的BglII位点和SalI位点引入所述XcmI盒构成前T载体pEGFP-UC，或在出发载体pGL3-basic的多克隆位点的MluI位点和XhoI位点引入所述XcmI盒构成前T载体pGL3-UC或在出发载体pSEAP2-basic的多克隆位点的MluI位点和XhoI位点引入所述XcmI盒构成前T载体pSEAP2-UC；所述间隔DNA序列为带有与出发载体具有不同抗性基因或其它选择标记的序列，所述用于制备前T载体pEGFP-UC的XcmI盒的间隔DNA序列为质粒pUC18全序列，所述用于制备前T载体pGL3-UC的XcmI盒的间隔DNA序列为质粒pUC-K序列，所述用于制备前T载体pSEAP2-UC的XcmI盒的间隔DNA序列为质粒pUC-K序列，所述质粒pUC-K的特征为以卡那霉素抗性基因取代pUC18中的氨苄青霉素抗性基因，其余序列与pUC18相同；所述XcmI盒由PCR扩增得到，pUC-F和pUC-R用于扩增pUC18，pUC-KF和pUC-R用于扩增pUC-K；pUC-F：5’-CGAAGATCTAGACCAAGTTTACTCA-3’pUC-R：5’-CAACTCGAGACAGTTACCAATGCT-3’pUC-KF：5’-CGAACGCGTAGACCAAGTTTACTCA-3’三条引物的5’端分别引入限制性内切酶BglII、XhoI和MluI的识别位点，用单线标示；XcmI酶识别位点用斜体标示；在pUC-F和pUC-KF引物的XcmI识别位点中尚包含稀有限制酶位点PmeI位点的前半部分即GTTT，最后一个T将构成XcmI酶切割得到的3’突出T，用波线标示，用于启动子PCR产物的定向克隆分析；2)用XcmI酶或XcmI酶的同裂酶酶切步骤1)中的前T载体，得到T载体。