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小轴海绵不同类型细胞和细胞团的分离制备方法，其特征在于：可按如下步骤操作，(1)小球细胞特异聚集：取健康洁净的小轴海绵组织，切成约0.5‑2mm厚的片状，在含EDTA的无钙镁海水CMFSW中用镊子轻轻挤压，得到的混合细胞液经300‑350目筛绢过滤后于平皿中静置，待小球细胞特异聚集成团块后，水平振荡平皿使聚集体重悬，待其自然沉降后吸取上清细胞悬液，为细胞悬液A；并添加含EDTA的CMFSW，反复进行水平振荡平皿、吸取上清细胞悬液和添加含EDTA的CMFSW的操作，平皿中剩余的细胞聚集体即为小球细胞富集体，对该聚集体用无菌天然海水进行培养，得到I型细胞团；(2)低速离心：将细胞悬液A离心，离心力30‑40g，细胞沉淀用无钙镁海水重悬，得到细胞悬液，为细胞悬液B，接种至无菌天然海水中培养得到II型细胞团；(3)速率沉降：将细胞悬液B，经蔗糖或泛影葡胺介质速率沉降后收集中间细胞条带，离心后重悬得到细胞悬液，为细胞悬液C；(4)高速离心：将细胞悬液A经30‑40g离心后的上清细胞悬液再次离心，离心力90‑110g，细胞沉淀用无钙镁海水重悬，得到的细胞悬液D，将细胞悬液D接种至无菌天然海水中培养，得到III型细胞团；(5)密度梯度离心：细胞悬液C，经密度梯度离心可分别得到灰细胞和原细胞的富集体，细胞悬液D经密度梯度离心，得到领细胞的富集体；所用无钙镁海水(CMFSW)的组分为氯化钠(NaCl)30‑35g/L，无水硫酸钠(Na2SO4)0.99g/L，氯化钾(KCl)0.75g/L，三羟甲基氨基甲烷(Tris‑Base)2.42g/L，余量为水；含EDTA的无钙镁海水中，EDTA的浓度为15‑30μM；步骤(1)中水平振荡平皿后，等待聚集体沉降的时间为20‑30秒；步骤(3)中所用蔗糖介质为无钙镁海水配制，浓度10％‑12％(g/ml)，泛影葡胺介质为76％的泛影葡胺原液以无钙镁海水稀释成为体积浓度7.5％‑10％溶液，下层介质与上层细胞液之间的体积比为2∶1‑4∶1，沉降时间为10‑20min；步骤(5)中细胞悬液C的密度梯度离心条件上层为体积浓度14％‑16％泛影葡胺，下层为体积浓度30％‑32％的泛影葡胺，40g，8‑10min离心；细胞悬液D的密度梯度离心条件上层为体积浓度10％‑12％泛影葡胺，下层为体积浓度20％‑22％的泛影葡胺，90g，8‑10min离心。 |
