应用家蚕生物反应器制备人DNA聚合酶δ的方法

摘要

本发明涉用应用家蚕生物反应器制备人DNA聚合酶δ的方法。具体是将人DNA聚合酶δ的4个亚基分别构建到供体质粒上；在经过改造的大肠杆菌DH10Bac/BmNPV中和家蚕BmNPV杆状病毒DNA中Tn7转座子上发生转座，筛选出带有正确亚基的克隆，随后在家蚕BmN细胞中制备该4种亚基不同装配组合的重组病毒；感染宿主家蚕，在家蚕体内进行多亚基蛋白复合物的表达和装配；收集感染后的幼虫体液或整体匀浆，经分离纯化后获得目的产物。通过本发明可以高效、低成本、大规模地制备高比活、正确装配的DNA聚合酶多亚基蛋白复合物；能够被广泛地应用于某些重要疾病、特别是癌症疾病研究领域涉及DNA复制和损伤修复之基础研究。

主权项

应用家蚕生物反应器制备人DNA聚合酶δ的方法，包括：将组成人DNA聚合酶δ的4个亚基p125、p68、p50和p12的基因分别构建到杆状病毒供体质粒pFastBac上，分别得到重组质粒pFastBac‑p125、pFastBac‑p68、pFastBac‑p50和pFastBac‑p12，在经过改造的大肠杆菌DH10Bac/BmNPV中和家蚕BmNPV杆状病毒DNA于 Tn7转座子上发生转座，通过蓝白斑筛选出带有正确亚基的克隆，随后在家蚕BmN细胞中制备该4种亚基不同装配组合的重组病毒，用获得的重组病毒感染宿主昆虫家蚕，在宿主昆虫家蚕体内表达并包装成多亚基蛋白复合物的人DNA聚合酶δ经分离纯化后获得；其中所述人DNA聚合酶δ的4个亚基p125、p68、p50和p12的基因是由下述4对引物分别扩增得到：p125： F: 5’‑AGCTACGGATCCGGATGGATGGCAAGCGGCGGCC‑3’       R: 5’‑AGCTACGAATTCTCACCAGGCCTCAGGTCCAGGG‑3’ p68：  F: 5’‑AGCTACGGATCCTTATGGCGGACCAGCTTTATCT‑3’        R: 5’‑AGCTACGAATTCTTATTTCCTCTGGAAGAAGCCA‑3’ p50：  F: 5’‑AGCTACGGATCCACATGTTTTCTGAGCAGGCTGC‑3’        R: 5’‑AGCTACGAATTCTCAGGGGCCCAGCCCCAGGCC‑3’ p12：  F: 5’‑AGCTACGGATCCCCATGGGCCGGAAGCGGCTCAT‑3’        R: 5’‑AGCTACGAATTCTCATAGGGGATAGAGATGCC‑3’；所述的分离纯化是指收集含表达并包装了人DNA聚合酶δ多亚基蛋白复合物的家蚕幼虫的体液或整体匀浆，在裂解缓冲液存在下经超声波裂解，40C下进行高速离心，收集的上清经过免疫亲和层析柱和离子交换层析柱分离纯化；所述的免疫亲和层析柱，是将抗p125的多克隆抗体与CarboLinkTM Coupling Gel耦联而制得。