一种检测脂肪酶活力抑制率的方法

摘要

本发明公开一种检测脂肪酶活力抑制率的方法。本发明方法包括如下步骤：A.准备试剂、橄榄油乳化液及测定酶液；B.建立脂肪酶测活体系；C.绘制脂肪酶抑制率“Y％”与pH变化幅度“△pH”关系标准曲线；D.样品溶液脂肪酶抑制率检测。本发明的检测方法是以脂肪酶活力为靶点，以对脂肪酶活力抑制程度为指标，根据脂肪酶作用原理，建立了一种检测脂肪酶抑制率的方法。此测定方法简便、灵敏、可靠、靶点明确、机理清楚，可以用于大量筛选各种具有脂肪酶抑制作用的物质，更进一步地用于筛选和开发减肥降脂药物。

主权项

一种检测脂肪酶活力抑制率的方法，其特征在于该方法包括如下步骤：A.准备试剂、橄榄油乳化液及测定酶液：三羟甲基氨基甲烷缓冲液制备：取三羟甲基氨基甲烷3‑4重量份，用0.1mol/L盐酸溶液调pH值至7.5‑9.5，加水至400‑600体积份，摇匀，再调节pH值至7.5‑9.5，定容至400‑600体积份；橄榄油乳化液的制备：取橄榄油10‑15体积份与阿拉伯树胶20‑25重量份，研磨均匀，加水研磨至200‑400体积份，用18000转/min的匀质机乳化1‑3次，每次2‑4分钟；取乳剂在显微镜下检查，90％乳粒的直径在3μm以下，并不得有10μm的乳粒，即可；牛胆盐溶液的制备：精密称取牛胆盐5‑10重量份，置于50ml烧杯中，以水溶解，转移至100ml容量瓶中定容；氢氧化钠溶液的制备：精密称取氢氧化钠1‑3重量份，加水溶解定容至500重量份；脂肪酶溶液的制备：精密称取标准脂肪酶于容量瓶中，用冷却至5℃以下的三羟甲基氨基甲烷缓冲液溶解，制成每1ml中含胰脂肪酶10～200活力单位的溶液，作为酶原液备用；绘制标准曲线时，将酶原液用三羟甲基氨基甲烷缓冲液稀释至不同浓度梯度的测定酶液；0U/ml的测定酶液是在水浴中煮沸15‑30分钟的酶原液，也可以用三羟甲基氨基甲烷缓冲液代替；B.建立脂肪酶测活体系：1).空白溶液脂肪酶测活体系：取橄榄油乳液20‑30重量份、牛胆盐溶液1‑3重量份与水5‑15重量份，置100ml三角瓶中，加空白溶液1‑3重量份，用0.1mol/L氢氧化钠溶液调节pH值至8‑10，空白溶液是水或乙醇；2).样品溶液脂肪酶测活体系：取橄榄油乳液20‑30重量份、牛胆盐溶液1‑3重量份与水5‑15重量份，置100ml三角瓶中，加样品溶液1‑3重量份，用0.1mol/L氢氧化钠溶液调节pH值至8‑10，样品溶液是用相应的空白溶液溶解或提取的具有潜在的抑制脂肪酶活力的物质的测定溶液；C.绘制脂肪酶抑制率“Y％”与pH变化幅度“ΔpH”关系标准曲线：绘制标准曲线时，先将不同梯度的测定酶液换算成对应的抑制率，抑制率换算公式：Y(％)＝(X0‑Xn)/X0Y(％)‑表示脂肪酶抑制率X0‑表示酶原液浓度(U/ml)Xn‑表示不同稀释度的酶液浓度(U/ml)；设定酶浓度为零时，抑制率为100％；设定酶原液浓度的抑制率为0，将酶原液按一定梯度稀释成90U/ml、80U/ml、70U/ml、60U/ml、50U/ml、40U/ml、30U/ml、20U/ml、10U/ml的测定酶液，则对应的抑制率Y％分别为10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％；空白酶液(0U/ml)是在水浴中煮沸15‑30分钟的酶原液或是用三羟甲基氨基甲烷缓冲液代替，按照标准曲线绘制法绘制标准曲线；标准曲线绘制法：将上述空白溶液脂肪酶测活体系在35‑40℃水浴中保温5‑15分钟，用0.1mol/L氢氧化钠溶液调节pH值至8‑10；精密量取上述不同浓度梯度的测定酶液1体积份，分别加至空白溶液测活体系中，在35‑40℃水浴中准确反应2‑30分钟，同时记录反应前后pH值，并计算反应前后的pH差值；用酶浓度为100U/ml时反应前后的pH差值，分别减去酶浓度为90U/ml、80U/ml、70U/ml、60U/ml、50U/ml、40U/ml、30U/ml、20U/ml、10U/ml、0U/ml时反应前后的pH差值，即得到对应不同抑制率的pH变化幅度“ΔpH”值；以抑制率“Y％”为纵坐标，“ΔpH”值为横坐标，绘制脂肪酶抑制率“Y％”与pH变化幅度“ΔpH”关系标准曲线，并得到相应空白溶液的抑制率计算公式；D.测定方法及样品溶液脂肪酶抑制率空白溶液测定：将空白溶液脂肪酶测活体系在35‑40℃水浴中保温5‑15分钟，用0.1mol/L氢氧化钠溶液调节pH值至8‑10；精密量取酶原液1体积份加至空白溶液测活体系中，在35‑40℃水浴中准确反应2‑30分钟，同时记录反应前后pH值，并计算空白溶液反应前后的pH差值，记为A1；另取在水浴中煮沸15‑30分钟的上述酶原液1体积份，照上述方法测定，作为酶空 白对照，pH差值记为A0；则空白溶液酶反应的pH变化值为ΔA＝A1‑A0；样品溶液测定：将样品溶液脂肪酶测活体系在35‑40℃水浴中保温5‑15分钟，用0.1mol/L氢氧化钠溶液调节pH值至8‑10；精密量取酶原液1体积份加至样品溶液测活体系中，在35‑40℃水浴中准确反应2‑30分钟，同时记录反应前后pH值，并计算样品溶液反应前后的pH差值，记为B1；另取在水浴中煮沸15‑30分钟的上述酶原液1体积份，照上述方法测定，作为酶空白对照，pH差值记为B0；则样品溶液酶反应的pH变化值为ΔB＝B1‑B0；样品溶液脂肪酶抑制率：用空白溶液酶反应的pH变化值“ΔA”减去样品溶液酶反应的pH变化值“ΔB”，得到空白溶液与样品溶液酶反应的“ΔpH”值，即ΔpH＝ΔA‑ΔB，将此“ΔpH”值代入相应的空白溶液脂肪酶抑制率计算公式，即得测定样品的脂肪酶抑制率；上述检测方法中重量份/体积份是g/ml的关系。