具有轴向选择性激发的荧光三维纳米分辨成像方法及装置

摘要

本发明适用于细胞等样品三维成像，提供了一种具有轴向选择性激发的荧光三维纳米分辨成像方法及装置。所述方法包括以下步骤：产生激发光和熄灭光；分光，将所述激发光分成第一激发光和第二激发光，将所述熄灭光分成第一熄灭光和第二熄灭光；调整所述第一激发光与第二激发光之间的相位差和强度比，调整所述第一熄灭光与第二熄灭光之间的相位差和强度比，使所述第一激发光与第二激发光和所述第一熄灭光与第二熄灭光在样品轴向的一个薄层或几个薄层处相干形成轴向调制照明实现轴向选择性激发。所述轴向选择性激发使大部分处于荧光态的荧光标记物集中分布在轴向几个或一个薄层内，大大抑制了厚样品成像时的背景噪声，提高了图像信息获取速率。

主权项

一种具有轴向选择性激发的荧光三维纳米分辨成像方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：产生激发光和熄灭光，所述激发光和熄灭光分别由激发光源和熄灭光源产生；分光，将所述激发光分成第一激发光和第二激发光，将所述熄灭光分成第一熄灭光和第二熄灭光；调整所述第一激发光与第二激发光之间的相位差和强度比，使所述第一激发光和第二激发光经相对放置的第一物镜和第二物镜后相干形成激发光轴向调制照明作用于样品，所述样品内均匀分布有荧光标记物，所述第一物镜和第二物镜分别位于所述样品的两侧，其中所述第一激发光与第二激发光之间的相位差为(2n+2)π，其中n为非负整数；调整所述第一熄灭光与第二熄灭光之间的相位差和强度比，使所述第一熄灭光和第二熄灭光经所述第一物镜和第二物镜后相干形成熄灭光轴向调制照明作用于所述样品，其中所述第一熄灭光与第二熄灭光之间的相位差为(2n+1)π±δ，其中n为非负整数，δ为所述第一熄灭光与第二熄灭光之间的相位差允许的误差值；探测荧光，由探测器探测所述荧光标记物发出的荧光；质心定位，根据探测到的荧光确定所述荧光标记物的二维位置；轴向扫描，轴向移动所述样品，或调整所述第一激发光与第二激发光之间的强度比和所述第一熄灭光与第二熄灭光之间的强度比，使所述第一激发光与第二激发光和所述第一熄灭光与第二熄灭光在所述样品的轴向不同位置实现所述轴向调制照明，探测所述荧光标记物发出的荧光，从而确定所述荧光标记物的轴向位置；三维重构，结合所述荧光标记物的二维位置及轴向位置，获取所述样品的三维纳米分辨图像。