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一种用于检测猪细小病毒的方法，其特征在于：包括以下步骤：1）以NADL‑2株猪细小病毒基因全序列,设计出分别扩增313bp片段的一对特异性引物；2）取增殖的猪细小病毒液300 μL，加入等体积样品裂解缓冲液，混匀，再加入蛋白酶K, 56℃水浴30min，然后加入等体积的平衡酚，混匀,10000 r/min离心5 min；取上清液，经酚:氯仿:异戊醇(25:24:1)再次抽提后用2倍体积的异丙醇沉淀，‑20℃放置30 min,12000 r/min离心10 min, 70%乙醇洗涤2次，干燥，加入20 μL 超纯水溶解，贮存于‑20℃备用；3）采用50 μL反应体系进行PCR扩增反应结束后，取5μL PCR产物用1%琼脂糖凝胶电泳检测PCR结果；4）回收PCR产物，将回收纯化的PCR产物与pGEM‑T Easy载体相连；5）取DH5α感受态细胞，加入连接产物10μL，冰浴30 min，42℃热休克90 sec，冰浴15 min，加入800μL不含抗生素的LB液体培养基，37℃ 250r/min振荡培养45min，8000rpm离心5min，弃上清液，加入200μL液体培养基重悬沉淀，再加入40μL的IPTG 20mg/mL和40μL的X‑gal 20mg/mL，混匀，均匀涂布于含50μg/mL Amp的LB固体平板上，37℃培养12h；6）提取质粒，以提取的质粒为模板做PCR鉴定，并用1%琼脂糖凝胶电泳检测PCR结果；7）阳性质粒，命名为pGEM‑VP2，提取质粒DNA，用蛋白核酸定量仪测定质粒浓度,10倍倍比稀释后作为标准样品制作标准曲线；8）选取猪细小病毒同一浓度的质粒标准品进行SYBR GreenⅠ实时定量PCR反应，验证此方法的重复性与稳定性；将已计算出拷贝数的质粒做10倍梯度稀释，进行敏感性试验；分别加入猪细小病毒、其它病毒和细菌的基因组作为模板同时设阴性对照，验证其特异性。 |
