利用胚挽救获得三倍体葡萄及倍性早期鉴定的育种方法

摘要

本发明公开了一种利用胚挽救获得三倍体葡萄及倍性早期鉴定的育种技术，其目的就是采用胚挽救技术培育三倍体葡萄，克服葡萄二倍体与四倍体常规育种杂交胚早期败育的缺陷，获得杂种幼苗，再结合流式细胞术、去壁低渗法染色体计数对所得杂种后代进行倍性的早期鉴定，提高三倍体葡萄的育种效率，加速了三倍体葡萄品种的选育进程，将为培育大粒无核葡萄品种开创广阔的前景。

主权项

利用胚挽救获得三倍体葡萄及倍性早期鉴定的育种方法，其特征是按以下步骤进行：1.a葡萄育种田间杂交采取花粉，在四倍体品种父本开花前1天或开花初期，采下发育正常的花序，除去顶部三分之一的部分，摘下花冠及花药后用纱网筛过后，在日光灯下烘干至花药裂开，再次筛后倒入研钵中，研磨至粉状，装入处理干净的小瓶，封口，放在装有无水CaCl2的干燥器中，4℃低温保存；去雄授粉，选择欧洲无核葡萄品种母本树上发育一致的花序若干，开花前3‑4天进行人工去雄，之后立即用清水喷洒花序，并套袋和挂牌标记，当柱头上开始分泌水滴状粘液时，用脱脂棉蘸取花粉进行人工授粉，连续授粉3次，每天1次；1.b胚挽救培养及成苗杂交去雄授粉40‑55天后，剥取杂交果穗中的胚珠进行胚挽救培养，将果穗洗净后置超净工作台上，75％乙醇浸泡1min，无菌水冲洗3‑5次，再用0.1％升汞消毒6min，无菌水冲洗3‑5次，切开果粒取出胚珠接种于内装40ml培养基的100ml三角瓶中，每瓶接种10‑20粒，胚珠培养基采用B5为基本培养基，附加0.1‑1.0mg/LBA、1.5‑2.5mg/LIAA、0.25‑0.75mg/LGA3、6％蔗糖、0.6％琼脂、0.1％活性炭；培养8周后，在无菌条件下剥取裸胚接种于胚萌发培养基中，以WP为基本培养基，附加0.1‑0.5mg/LIBA、2％蔗糖、0.6％琼脂、0.1％活性炭；继续培养10‑15天， 转移至成苗培养基进行继代培养，采用1/2MS为基本培养基，附加0.1‑0.3mg/LIBA、2％蔗糖、0.6％琼脂、0.1％活性炭，在成苗培养基中长出叶片后进行后继的倍性鉴定，培养条件为温度25℃±2℃，光照每天16h，光强度2000lux；1.c流式细胞仪对葡萄杂种后代进行半定量分析经胚挽救培养获得的杂交后代倍性的初步鉴定采用流式细胞术测定其DNA含量，取1‑2片幼嫩的叶片或少量愈伤组织放入培养皿中，加入0.5‑1.0ml的DNA提取液HR‑A，用刀片切碎后静置处理2‑5min后，将样品通过30μm的Partec CelltricsTM微孔膜过滤到测试管中，再加入2ml染色液HR‑B，随即将样品上样于Partec流式细胞仪，DNA的含量分布图由流式细胞仪自动生成，其中，先将父母本品种所产生的分析峰在横轴上的荧光值FL设定，固定参数，再依次对杂交幼苗的荧光值进行测定；1.d通过去壁低渗法染色体计数对所得的测定结果进行鉴定在超净工作台上取杂交试管苗的根尖或茎尖后，立即投入饱和的对二氯苯溶液中常温下处理2h‑3h；去除处理液，用蒸馏水冲洗数遍后注入配制的体积比甲醇∶冰乙酸＝3∶1的固定液，常温下处理3h‑5h；去除固定液，用蒸馏水冲洗干净，加入质量体积比3.5％的纤维素酶和果胶酶体积比1∶1的混合酶液，混合酶液和材料的比例为30∶1，在37℃恒温下酶解20‑30min；蒸馏水冲洗后在卡宝品红染色液中染色30min‑3h；取一小块材料放在经70％乙醇浸泡的载玻片上，滴上一滴卡宝品红染色液，用镊子捣碎后盖上盖玻片，然后按压住一角用木制小棒均匀敲打盖玻片，至材料分散成雾状，最后用吸水纸吸去多余的染色液，酒精灯上干燥后用OLMPUS‑BX51型显微数码摄影系统照相；1.e胚挽救幼苗的炼苗移栽春季选择壮苗4‑5条根，根长3‑5cm，4‑5片叶，茎秆粗壮，基部无愈伤组织，强光锻炼1周；将幼苗用无菌水冲洗后移栽到灭好菌的珍珠岩∶草炭＝1∶1混匀的基质中，培养室炼苗，在幼苗上罩塑料杯，每5‑10天浇灌1000倍的多菌灵和1/8MS营养液，并及时除去发霉的叶片和茎杆，温室温度控制在18‑25℃，相对湿度60‑70％，光照强度500‑1000lux；待移栽出的幼苗长出新根和新叶，在春季地温升高至18‑23℃时移至大田，移栽后立即搭遮荫网并灌足定根水，逐渐揭开遮荫网，并及时浇水和防病虫。