消除生物组织玻璃化法保存低温断裂的两步降温方法

摘要

本发明是消除生物组织玻璃化法保存低温断裂的两步降温方法，属于生物医学技术领域。两步降温是指首先在冷氮气中降温然后再转移至液氮。通过两步降温技术，可以适度地减小样品的降温速率，则可以减弱样品内的热应力，进而有望消除低温断裂；同时仍能保证样品的玻璃化。在执行两步降温时，应遵循以下操作：在降温的第一步，将样品置于氮气中-196～-135℃的温度范围内，在-80～4℃温度范围的降温速率应为10～30℃/min，以保证冻存样品在降温过程中实现玻璃化；当温度降到-196～-100℃范围内，即可将冻存对象浸入液氮，降温速率应为0～165℃/min，以避免溶液主体部分的断裂。实现两步降温的设备简单，主要包括杜瓦瓶或类似设备以及温度测量装置。

主权项

一种消除生物组织玻璃化法保存低温断裂的两步降温方法，其特征在于：步骤1，组织准备：获取角膜组织后，将其浸没于玻璃化溶液中，使保护剂充分渗透到组织内；玻璃化溶液为CPTES‑乙二醇‑葡萄糖‑硫酸软骨素，其中，乙二醇、葡萄糖和硫酸软骨素的质量百分比浓度分别为52％、8％和3％；然后，将组织放进冻存管底部，加入玻璃化溶液完全浸没组织，在组织上方保持3～100mm的液层高度，在冻存管顶部保持1～100mm的空气腔；步骤2，装置准备：向液氮容器内内倾倒液氮，盖上保温盖，稳定5～20min；确定氮气场中温度介于‑196～‑135℃所对应的位置，即第一步降温中样品允许放置的位置；然后放入支撑板，稳定5～20min；步骤3，降温操作：第一步：将盛有玻璃化溶液和生物组织的冻存管通过保温盖上的小孔竖直地放在支撑板上，同时监测样品的温度变化；第二步：待样品的温度降至‑196～‑100℃范围内，将支撑板翻转，使样品浸入液氮。