一种无差别扩增双链cDNA及基因组DNA的方法

摘要

本发明提供了一种无差别扩增双链cDNA及基因组DNA的方法。所述方法包括：构建含有稀有限制性内切酶I-SceI识别位点的OligodT引物I-SceIdT，利用该引物对样品RNA进行逆转录合成第一链cDNA；往第一链cDNA中加入RNAseH酶和DNA Polymerase I酶，合成双链cDNA，然后抹平双链cDNA末端(基因组DNA扩增从此步骤开始做)，接着使双链cDNA(或基因组DNA)的3‘末端加上碱基A，最后在双链两端都加上接头Zip T，使双链DNA可以变性成单链环状结构，在phi29DNA聚合酶作用下进行滚环扩增，产生大量双链cDNA或基因组DNA。本发明方法能够高效并切无差别的扩增各种cDNA及基因组DNA，对珍稀样本的基因组DNA和cDNA有扩大保存的作用，并能高效的扩增高GC含量以及复杂二级结构的DNA。

主权项

一种无差别扩增双链cDNA的方法，其特征在于所述方法如下：(1)构建含有稀有限制性内切酶I‑SceI识别位点的Oligo dT引物I‑SceIdT，利用该引物对样品RNA进行逆转录合成第一链cDNA；所述引物I‑SceIdT序列如下：GACGCTAGGGATAACAGGGTAATTTTTTTTTTTTTTTTVN；下划线部分为内切酶I‑SceI识别位点，V表示碱基A、C或G，N表示碱基A、T、C或G；(2)往第一链cDNA中加入RNaseH酶和DNA Polymerase I酶，合成双链cDNA；(3)往双链cDNA中加入T4 DNA polymerase抹平双链cDNA末端；(4)步骤(3)产物加入Taq DNA polymerase使双链cDNA的3‘末端加上碱基A；(5)步骤(4)产物在T4 DNA ligase和T4 polynucleotide kinase的作用下在双链cDNA两端都加上接头Zip T；所述接头Zip T序列如下：GCGGCCGCACGCTAGGGATAACAGGGTAATGCGGCCGCT；下划线部分为内切酶I‑SceI识别位点；(6)步骤(5)产物在phi29 DNA聚合酶作用下进行滚环扩增，产生大量双链cDNA。