植物端粒酶活性的检测方法

摘要

本发明公开了一种植物端粒酶活性的检测方法，依次包括以下步骤：1)植物端粒酶初提取液制备；2)植物端粒酶的富集：每10ml初提液中加入0.9～11克经DEPC处理的PEG6000；3)蛋白含量的测定：取步骤2)所得富集上清液测定蛋白含量；4)端粒酶的酶促反应及产物的回收：将灭活预处理后富集上清液作为对照组；将富集上清液作为实验组；经处理后，分别得对照组回收产物/实验组回收产物；5)DNA含量测定：将步骤4)所得的对照组回收产物/实验组回收产物分别加入无菌水充分溶解；然后分别测定ssDNA的量；将实验组回收产物的ssDNA含量减去对照组回收产物的ssDNA含量，得植物端粒酶活性值。

主权项

植物端粒酶活性的检测方法，其特征是依次包括以下步骤：1)、植物端粒酶初提取液制备：利用液氮将待测植物组织充分研磨后，于3～5℃加入提取液后继续研磨成匀浆；然后，3～5℃，15000～17000g离心12～17min，所得的上清液作为初提液；每100ml的所述提取液中，含有50mM pH 7.5Tris‑HCl、5.0mM MgCl2、100mM KCl、20mM EGTA、1.0mM DTT、0.1mM PMSF、1.5g PVP和10ml甘油，其余为水；植物组织与提取液的用量比为：2.5g待测植物组织/8～12ml提取液；2)、植物端粒酶的富集：每10ml初提液中加入0.9～11克经DEPC处理的PEG6000，于3～5℃下上下颠倒至PEG6000充分悬浮后继续震荡30min；然后于3～5℃、15000～17000g离心12～17min，去除上清后，加入3～4ml提取液，3～5℃悬浮搅拌，再于3～5℃、15000～17000g离心12～17min，得富集上清液；3)、蛋白含量的测定：取步骤2)所得富集上清液测定蛋白含量；4)、端粒酶的酶促反应及产物的回收：取步骤2)所得的富集上清液的一部分，经65℃15min灭活预处理，得灭活预处理后富集上清液作为对照组；步骤2)所得的富集上清液的另一部分，作为实验组；将对照组和实验组分别进行以下处理：取含有100mg蛋白的灭活预处理后富集上清液/含有100mg蛋白的富集上清液放入离心管中，加入30μl 10×酶促反应液，用ddH20定容至300μl，18～20℃保温12～14min；然后92～96℃酶灭活处理0.8～1.2min；再加入280～320μl的氯仿，充分混匀，于3～5℃，20000～22000g离心12～17min，取上清，加入1/10氯仿体积量的3M醋酸钠溶液以及加入异丙醇，混匀，再置于‑18～‑22℃冷冻50～70min，所述异丙醇的体积是氯仿和3M醋酸钠溶液体积量之和的0.8～1.2倍；再3～5℃、20000～22000g离心18～22min，去除上清后，用体积浓度为70～80％的乙醇洗涤沉淀；待沉淀自然干燥后，分别得对照组回收产物/实验组回收产物；5)、DNA含量测定：将步骤4)所得的对照组回收产物/实验组回收产物分别加入无菌水充分溶解；然后分别测定ssDNA的量；将实验组回收产物的ssDNA含量减去对照组回收产物的ssDNA含量，得植物端粒酶活性值。