一种杨梅组织培养的方法

摘要

本发明公开了一种杨梅组织培养的方法，属于植物组织培养技术领域。该方法包括：（1）培养基的配制；（2）杨梅无菌苗的培养等步骤。本发明针对杨梅枝条的特点，提出了独突、高效的灭菌方法，使杨梅外植体污染率由改进前的80~90%降低为40~50%，从而成功建立起杨梅无菌苗的培养体系，有效突破了杨梅组织培养中外植体污染率高的技术障碍，为现行杨梅生产栽培品种的改良奠定了技术基础。本发明可在杨梅品种改良研究与优良品种的快速繁育中推广应用。

主权项

一种杨梅组织培养的方法，其特征在于按如下步骤进行：(1)培养基的配制，包括基本培养基和各阶段培养基的组分及各组分在每升培养基中所含重量为：1)基本培养基：其中，初始诱导、芽伸长和增殖以WPM为基本培养基，该培养基中蔗糖为30g/L，琼脂粉为6～7g/L，pH为5.6～5.8；生根以1/2MS为基本培养基，该培养基中蔗糖为20g/L，琼脂粉为6g/L，pH为5.6；所述的WPM基本培养基配方为：大量元素：硝酸铵NH4NO3 400mg/L，硫酸钾K2SO4 900mg/L，磷酸二氢钾KH2PO3 170mg/L，硫酸镁MgSO4·7H2O370mg/L；钙盐：氯化钙CaCl2·2H2O 96mg/L；四水合硝酸钙Ca(NO3)2·4H2O 556mg/L；微量元素：硼酸H3BO3 6.2mg/L，硫酸锰MnSO4·4H2O 22.5mg/L，硫酸锌ZnSO4·7H2O 8.6mg/L，钼酸钠Na2MoO4·2H2O 0.25mg/L，硫酸铜CuSO4·5H2O0.25mg/L；铁盐：乙二胺四乙酸二钠Na2‑EDTA 37.3mg/L，硫酸亚铁FeSO4·7H2O27.8mg/L；有机酸：肌醇100mg/L，甘氨酸2mg/L，盐酸硫胺素1mg/L，盐酸吡哆醇0.5mg/L，烟酸0.5mg/L；所述的1/2MS基本培养基配方为：蔗糖20g/L，琼脂粉6g/L，pH为5.6，大量元素：硝酸铵NH4NO3 825mg/L，硝酸钾KNO3 850mg/L，磷酸二氢钾KH2PO385mg/L，硫酸镁MgSO4·7H2O 185mg/L；钙盐：氯化钙CaCl2·2H2O 220mg/L；微量元素：碘化钾KI 0.83mg/L，硼酸H3BO3 6.2mg/L，硫酸锰MnSO4·4H2O 22.3mg/L，硫酸锌ZnSO4·7H2O 8.6mg/L，钼酸钠Na2MoO4·2H2O 0.25mg/L，硫酸铜CuSO4·5H2O 0.025mg/L，氯化钴CoCl2·6H2O 0.025mg/L；铁盐：乙二胺四乙酸二钠Na2‑EDTA 37.3mg/L，硫酸亚铁FeSO4·7H2O 27.8mg/L；有机酸：肌醇100mg/L，甘氨酸2mg/L，盐酸硫胺素0.5mg/L，盐酸吡哆醇0.5mg/L，烟酸0.5mg/L；2)初始诱导培养基Y1：WPM+6‑BA 0～0.1mg/L+NAA 0～0.02mg/L+PVP0.8～1.0g/L；3)新芽伸长及增殖培养基Y2：WPM+6‑BA 0.5mg/L+NAA 0.4～0.5mg/L+GA3 0.3～0.4mg/L+PVP 0.8～1.0g/L；4)生根培养基Y3：1/2MS+IBA0.5mg/L，pH为5.6；(2)杨梅无菌苗的培养：1)外植体的选择及灭菌：以当年新生直径3～4mm的杨梅枝条为外植体，剪去叶片、插入清水瓶中在室内养护1～2d后，以自来水冲洗10～20min，并将该枝条剪成2～3cm的茎段；在超净工作台上先将茎段在其3倍体积的70％酒精中浸泡、摇动25～30s；倒去酒精并用灭菌水冲洗2～3遍后，再在其3倍体积的0.1％升汞溶液中浸泡、摇动灭菌7～8min，最后用无菌水冲洗5～7遍，并用灭菌剪刀将茎段两端各剪去1～2mm组织后，备用；2)初始诱导培养：将灭菌后外植体茎段按末端向下插入初始诱导培养基Y1中，在22～26℃、光强2000～3000Lx、光照12h/d条件下进行初始培养；培养3～5d后将其中未污染的外植体茎段转接到新的Y1培养基中，并继续培养10～15d至新芽长出；3)新芽伸长培养：将长出新芽的外植体茎段剪去发黑端部后转插入Y2培养基中进行新芽伸长培养，在22～26℃、光强2000～3000Lx、光照12h/d条件下培养14～21d，至新芽伸长到≥0.5cm；4)增殖培养：将步骤3)新芽剪下并转接到Y2培养基中，在22～26℃、光强2000～3000Lx、光照12h/d条件下进行增殖培养28～30d，至新芽长出并伸长到1cm以上；5)生根培养：将步骤4)长至1cm以上的新芽剪下，并剪去末端叶片后转接到生根培养基Y3，在22～26℃、光强2000～3000Lx、光照12h/d条件下培养，14～17d后陆续长出新根即成杨梅组培苗。