一种百合脱毒籽球的快速培养方法

摘要

本发明公开了百合籽球生产的综合脱毒技术，即通过在35-38℃条件热处理栽种百合种球7-15天、剥取热处理后百合种球茎尖生长点为外植体，接种于病毒唑(Ribavirin)含量5-10mg/L的培养基中脱毒培养，用酶联免疫吸附测定实验(ELISA)和RT-PCR检测对脱毒组培苗进行百合无症病毒(LSV)、黄瓜花叶病毒(CMV)和百合斑驳病毒(LMoV)病毒病毒的检测，此发明通过综合脱毒技术确保培养出的百合籽球去除病毒感染，并优化了脱毒百合种球组培培养基成分和培养程序，快速培养得到脱毒组培籽球，属于植物组培快繁技术领域和植物细胞工程领域技术。

主权项

利用生物反应器快速培养百合脱毒种球的方法，按如下步骤进行：(1)外植体灭菌和生长点的剥取：在35‑38℃条件下种植百合种球，经过7‑15天的培养，待芽长高并绽开成莲座状，开始采集百合茎尖，用中性肥皂水清洗3‑5分钟，自来水冲洗过夜，0.1％升汞灭菌5‑10分钟，然后在70％酒精浸泡10‑15秒。取出茎尖，先用加吐温灭菌水冲洗2‑3分钟，再用灭菌水冲洗5‑6遍。外植体清洗干净后，开始剥取生长点，先将茎尖的叶片全部剥除，用解剖针挑取百合茎尖生长点，生长点长度为0.4‑0.8(mm)，将剥取的生长点立即接种。(2)脱毒培养：，步骤①诱导培养，剥取的百合茎尖生长点接种到诱导培养基(1/2MS+6‑BA 1.0‑2.0mg/L+NAA0.2‑0.5mg/L+4％蔗糖+琼脂粉6g/L(pH 5.8))，经过40‑60天培养，生长点膨大成直径2‑3(cm)的叶丛。②将叶丛切成0.5(em)小块，接种于含病毒唑的培养基(MS+NAA0.2‑0.5mg/L+4％蔗糖+病毒唑(Ribavirin)5‑10mg/L+琼脂粉5g/L+0.5％活性炭(pH5.8))，经过40‑60天培养，形成带球的瓶苗。(3)病毒检测：将步骤②瓶苗送到，农业部花卉产品质量监督检验测试中心(昆明)，经检测确认无任何病虫害现象并不带百合无症病毒(LSV)、黄瓜花叶病毒(CMV)和百合斑驳病毒(LMoV)等病毒，才确认是百合脱毒种苗。(4)脱毒籽球诱导培养：经过病毒检测，将步骤②脱毒瓶苗转移到籽球诱导培养基(MS+KT 2‑5mg/L+NAA0.2‑0.5mg/L+4％蔗糖+琼脂粉5g/L+0.5％活性炭(pH 5.8))，在温度22±1℃，光照强度1500Lx，光照12h/d的环境条件下培养40‑60d，直接诱导出脱毒籽球。(5)增殖培养：将步骤(4)组培籽球，切去叶片和部分基部组织后，纵切成3‑4块直径0.3‑0.5cm材料，接种于和籽球诱导培养相同的培养基上，在温度22±1℃，光照12h/d，光照强度1000‑1500Lx的环境条件下培养2个月，可以扩繁3‑4倍。(6)脱毒籽球在生物反应器内液体培养：将步骤(5)培养的组培籽球分开，形成单个的小籽球，大约直径0.3‑0.5cm，然后接种于反应器内。液体培养基(MS+NAA 0.2‑0.5mg/L+吡效隆CPPU 1‑4mg/L+6％蔗糖(pH 5.8))，在22±1℃、1500Lx和2L/min通气量条件下培养45天，培养籽球直径可达1.0‑1.4cm，根系在3‑5条/粒，籽球重0.7‑1.2g/粒。(7)冷藏：取出步骤(6)培养的脱毒籽球，用清水冲洗掉培养液，包裹于消毒草炭中，经3‑4℃冷藏处理30‑40天打破休眠。(8)移栽驯化：将步骤(7)籽球取出，用2000倍阿米西达药液浸泡籽球20分钟，然后定植到80‑90穴的穴签中，穴盘基质：草炭1份、蛭石1份加少量促生根的菌肥拌匀装盘。定植后浇透水，并用地膜覆盖穴盘。放到网室内养护，昼温20‑25℃，夜温10‑15℃，盘土保持湿润，定植成活后，每周喷一次1/2MS营养液。(9)待籽球直径长到2cm以上，可选择具夏季冷凉气候的800～1000米海拔地区，在避雨和防虫隔离条件下，3月下旬至4月中旬定植到苗床里。