一种快速检测样品中大肠埃希杆菌O157∶H7的试剂盒及检测方法

摘要

一种快速检测样品中大肠埃希杆菌O157∶H7的试剂盒及检测方法，属于免疫学检测技术领域。本发明利用加热灭活的大肠埃希杆菌O157∶H7免疫原免疫健康的新西兰大白兔得到多克隆抗体作为包被抗体，免疫BALB/C小鼠并进行细胞融合得到单克隆抗体作为二抗，建立了食品（肉类）中大肠埃希杆菌O157∶H7的双抗夹心酶联免疫法的试剂盒，为大肠埃希杆菌O157∶H7在食品中的残留检测提供了快速高效的检测手段，费用较低并且稳定性和重复性较好。检测限为105cfu/mL，适合样品的大批量检测。

主权项

一种大肠埃希杆菌O157∶H7的双抗夹心酶联免疫检测试剂盒，其特征在于利用加热灭活的大肠埃希杆菌O157∶H7免疫原免疫健康的新西兰大白兔得到多克隆抗体作为包被抗体，免疫BALB/C小鼠并进行细胞融合得到单克隆抗体作为二抗，建立了大肠埃希杆菌O157∶H7的双抗夹心酶联免疫法的试剂盒；大肠埃希杆菌O157∶H7即ATCC 35150，所述试剂盒由以下几部分组成：（1）反应板：以0.05M的碳酸盐缓冲溶液稀释的多克隆抗体，包被96孔酶标板，每孔100μL；4℃孵育过夜，按照常规ELISA方法封闭洗涤，为试剂盒中的反应板；（2）大肠埃希杆菌O157∶H7阳性对照标准品；阴性对照标准品；大肠埃希杆菌O157∶H7接种在山梨醇麦康凯SMAC平板上，37℃培养24h，挑取单菌落接种于改良E.C新生霉素增菌肉汤37℃、200r/min振荡培养17h，计数，沸水浴加热1夜灭活，生理盐水调整大肠埃希杆菌O157∶H7浓度至5×109cfu/mL，为免疫原；用灭菌PBS缓冲液调整大肠埃希杆菌O157∶H7浓度为107cfu/mL为阳性对照标准品，灭菌PBS缓冲液为阴性对照标准品；（3）以抗体稀释液稀释的单克隆抗体抗血清；抗体稀释液：含0.1%明胶的PBST溶液；（4）酶标二抗：以抗体稀释液稀释的辣根过氧化物酶标记的羊抗鼠GAM‑HRP；（5）显色液A：0.933 g柠檬酸，3.68 g Na2HPO4·12H2O，18 μL 30%H2O2用超纯水定容至100 mL；显色液B：60 mg 3,3/,5,5/‑四甲基联苯胺TMB溶于100 mL乙二醇中；使用前将A与B以5:1体积混合；（6）终止液：2M 硫酸溶液。