生产水牛诱导多能干细胞的方法

摘要

本发明公开了一种生产水牛诱导多能干细胞的方法，采用逆转录病毒载体携带特异性转录因子Oct4，Sox2，Klf4，c-Myc，Nanog，Lin28和细胞永生化基因SV40large T(LT)，将水牛体细胞，如胎儿成纤维细胞，直接重编程为具有类似于胚胎干细胞特性的诱导多能干细胞。水牛诱导多能干细胞的产生，可以提供一种获得水牛干细胞的新途径，可以在一定程度上弥补水牛胚胎干细胞难分离、难培养、难建系的问题，水牛诱导多能干细胞的产生，更是为水牛干细胞信号通路及建系的研究提供干细胞来源，同时也为水牛定向遗传改良提供一条新的途径。

主权项

一种生产水牛诱导多能干细胞的方法，其特征在于主要包括以下步骤：<1>特异性转录因子的克隆 分别提取水牛生殖嵴和293‑T细胞的总RNA，采用RT‑PCR技术，克隆出水牛干细胞的特异性转录因子Oct4，Sox2，Klf4，c‑Myc，Nanog，Lin28和细胞永生化基因SV40large T，分别连接到PMD‑18T载体上，经测序验证和多重序列比较后，确认目的片段正确；<2>逆转录病毒表达载体的构建 以pMX逆转录病毒载体为基本骨架，目的片段经酶切后，连接到pMX载体上，构建出生产水牛诱导干细胞的逆转录病毒载体pMX‑Oct4‑IRES‑GFP，pMX‑Sox2，pMX‑Klf4，pMX‑c‑Myc，pMX‑Nanog，pMX‑Lin28，pMX‑LT；其中，为了检测诱导过程中，外源转基因的表达和沉默，将IRES‑GFP连接到pMX‑Oct4下游，在同一个启动子的作用下，同时表达Oct4和绿色荧光标记基因GFP；<3>病毒的包转将携带特异性转录因子的载体分别与包膜质粒pCMV‑VSVG用脂质体法共转染包装platinum‑GP细胞；转染48小时和72小时收集病毒上清液2次；新鲜的病毒上清或者经过超速离心后，采用批量快速测定法测定病毒滴度；其中，新鲜病毒的滴度为4×106IU/mL，经超离后可达1×108IU/mL以上；<4>水牛诱导多能干细胞的制备诱导的水牛体细胞为组织块法分离和培养的水牛胎儿耳部成纤维细胞，将携带转录因子的病毒上清等比例混合，以不同的组合OS，OSK，OSKM，OSKMT，OSKMNL，OSKMNLT感染水牛胎儿成纤维细胞，确定能诱导出水牛干细胞的最佳组合；其中，未经超离的病毒上清连续感染靶细胞2次，每次感染12h；超离后的病毒上清采用1次感染20h；经病毒感染后的细胞，胰酶消化，以5×104的密度接种到预先经过丝裂霉素处理好的小鼠胎儿成纤维细胞上，并改换含有白血病抑制因子和成纤维样生长因子的干细胞培养基，每2‑3天换液一次；在感染后12‑18天，水牛诱导干细胞的初始克隆开始形成；到18‑24天克隆形态明显，并表现出类似于小鼠胚胎干细胞样的形态；挑取克隆，并用1ml的注射器针头将克隆分成小块，或者用胰酶消化成小块之后接种到MEFs上继续扩增。