用于T淋巴细胞的体外培养方法

摘要

一种用于T淋巴细胞的体外培养方法，从根本上解决现有T淋巴细胞的体外培养方法存在的成本高、使用不方便、且不利于医学研究和临床应用的问题，本发明包括对T淋巴细胞进行定向分选、诱导、分化、培养、扩增等步骤，采用了特殊的细胞因子组合用于对T淋巴细胞进行诱导分化，这三种因子分别是CD3单克隆抗体、γ-干扰素、白细胞介素-1α，这三种因子的最佳浓度比例为10∶1∶1，这三种因子在培养基中的总终浓度为1200ng/ml，实验表明这种组合是诱导T淋巴细胞分化的极有效的方式。

主权项

一种用于T淋巴细胞的体外培养方法，包括对T淋巴细胞进行定向分选、诱导、分化、培养、扩增，其特征在于：具体操作步骤如下：第一步、对T淋巴细胞进行定向分选：将稀释好的血细胞以1：1的比例缓慢注入细胞分选液上，并离心处理；用移液管吸出分选后的第一层液体即血浆或细胞组织均浆液层，弃去，吸取第二层细胞即环状乳白色淋巴细胞于新的离心管中；向新收集的细胞中补加生理盐水，离心处理后弃上清；重复洗两次；其中细胞分选液的配制方法为：取9% Ficoll溶液720ml与33.4%泛影葡胺30ml充分混合，再向该混合液中加入7.5g的明胶，充分混匀；用高浓度的泛影葡胺或稀释的Ficoll来调整溶液的相对密度至1.077g/ml；最后放入温度为121℃的高压蒸汽灭菌中30min，室温保存备用；第二步、对T淋巴细胞进行诱导、分化、培养：取包被瓶一个，所述包被瓶是预先包被了CD3单克隆抗体、γ‑干扰素、白细胞介素‑1α三种因子的细胞培养瓶，用生理盐水或培养基润洗一次并弃去，加入患者自体血浆2~5ml；取培养基重悬细胞，混匀后将其移入包被瓶中；而后用培养基润洗离心管，将润洗液再次移入包被瓶中；将包被瓶放入5% CO2、37℃的培养箱中培养24h；包被瓶的制备：取CD3单克隆抗体、γ‑干扰素、白细胞介素‑1α加入到40ml磷酸盐缓冲液中，CD3单克隆抗体、γ‑干扰素、白细胞介素‑1α三种因子的浓度比例为10:1:1，制成总浓度为1200ng/ml的混合溶液，充分混匀；将该混合溶液加入到600ml培养瓶中，4℃静置至少24小时，制成初始包被瓶；将初始包被瓶在‑40℃条件下冷冻24小时；启动冷冻干燥机的压缩机，使机器腔室内的温度降至‑40℃，将包被瓶瓶口拧松，放入干燥室；开启真空泵，使压力达到<15Pa，真空冻干20小时；打开CO2进气阀，关闭真空泵；待压力到110K后关闭CO2进气阀，取出包被瓶，拧紧盖子，封好口，4℃保存；在规定的保质期内使用；第三步、对T淋巴细胞进行扩增：吸取新鲜培养基溶解细胞因子A，即20万单位的白细胞介素‑2，注入包被瓶中，此时细胞因子A在培养瓶中的浓度为0.4万单位/ml；于5%CO2，37℃培养箱中培养2~3天后，向包被瓶中补加新鲜培养基100ml；再于5% CO2，37℃培养箱中继续培养1~2天，当细胞基本铺满包被瓶底时，进行转袋；用移液管吹下包被瓶中的贴壁细胞，用注射器吸取新鲜培养基溶解细胞因子B，即200万单位的白细胞介素‑2，加入包被瓶中，同时加入患者自体血浆2~5ml，将培养瓶中的细胞培养液倒入培养袋中；用新鲜培养基润洗包被瓶两次，将润洗液一并倒入培养袋中，补加培养基至1000ml，此时细胞因子B在培养瓶中的浓度为0.2万单位/ml；将培养袋放入5%CO2，37℃培养箱中培养3~4天后，补加新鲜培养基1000ml，继续放入5%CO2，37℃培养箱中培养；补液后第二天，进行检菌，证明培养袋中的培养物是否可以用于回输治疗或医学研究。