复合检测禽流感和新城疫病毒的试剂盒及检验方法

摘要

本发明涉及复合检测禽流感和新城疫病毒的试剂盒及检验方法，其特征在于该试剂盒包括：裂解液、RT-PCR缓冲液、引物及探针混合液：其中含有检测各亚型禽流感病毒的引物及探针序列和检测新城疫中强毒的引物及探针序列、酶混合物、DEPC水以及阴性和阳性对照。检验方法包括RT-PCR反应，质控标准和结果判定。本发明灵敏度高，特异性好，操作简单；从样品处理到出结果仅需4小时；克服了单重荧光的不足，实现了一次实时荧光定量PCR反应同时检测两种病毒的目的。

主权项

复合检测禽流感和新城疫病毒的试剂盒，其特征在于该试剂盒包括以下组分：1)裂解液：100％Trizol；2)RT‑PCR反应液：内含浓度为25mmol/L MgCl2，10mmol/L dNTP Mixture；3)引物及探针混合液；检测禽流感病毒上下游引物和检测新城疫病毒上下游引物按终浓度为20pmol/L等比例混合，检测禽流感病毒探针和新城疫病毒探针按终浓度为10pmol/L等比例混合；其中所涉及的检测H5、H7和H9亚型禽流感病毒的引物及探针序列为：禽流感病毒上游引物：5’‑CGGACGAAAAGGCAACGA‑3’；禽流感病毒下游引物：5’‑CATTGTCTCCGAAGAAATAAGATCCT‑3’；禽流感病毒探针：JOE‑CGATCGTGCCCTCCTTTGACATGAGT‑TAMRA；检测新城疫病毒中强毒的引物及探针序列为：新城疫病毒上游引物：5’‑TGCTCACTCCTCTTGGYGAT‑3’新城疫病毒下游引物：5’‑TGCTGTTAYCTGTGCCGCHG‑3’新城疫病毒探针FAM‑CACCTATAAAGCGTTTYTGTCTCCTTCCTCC‑TAMRA其中Y代表嘧啶，此处为T或C，H代表嘌呤和嘧啶，此处为A或C或T；4)酶混合物：浓度均为5U/μL的AMV反转录酶与Taq酶按1；1比例混匀分装；5)DEPC水：内含浓度为1‰的焦炭酸二乙酯；6)阴性对照：灭活尿囊液，采自孵育至9日龄的SPF鸡胚，无菌抽取其鸡胚尿囊液，60℃作用1小时灭活制备；7)阳性对照：利用AIV NP基因保守区和NDV F基因裂解位点区构建的cDNA质粒。