一种适用于农杆菌介导的悬铃木组织培养方法

摘要

本发明一种适用于农杆菌介导的悬铃木组织培养方法，属于植物组织培养方法。在建立悬铃木微繁株系中，采用壮苗培养基、过渡培养基与微繁培养基进行轮流继代保证微繁苗生长旺盛与微繁苗内源激素水平的基本稳定。在不定芽诱导培养中，采用在过渡培养基上生长30天的叶片进行不定芽的分化，不定芽再生频率稳定在80％以上。该发明采用的微繁苗的轮流继代培养，保证了充分的叶片外植体来源以及高频率的叶片不定芽再生频率，从而更适合用作农杆菌介导法基因转化的受体材料。用该不定芽再生体系进行农杆菌介导已将nptII基因导入悬铃木株系中。

主权项

一种适用于农杆菌介导的悬铃木组织培养方法，其特征在于，(1)材料选用株体健壮挺拔的悬铃木当年生枝条茎段为外植体材料；(2)培养基基本培养基：WPM或MS，蔗糖质量比3％，琼脂条质量比0.8％；腋芽启动培养基：WPM+0.1mg/L玉米素(ZT)+0.1mg/L 6‑苄氨基嘌呤(6‑BA)+0.01mg/L吲哚丁酸(IBA)微繁培养基：MS+2.0mg/L 6‑BA+0.5mg/L激动素(KT)+0.1mg/L IBA壮苗培养基：MS+2.0mg/L ZT+0.5mg/L KT+0.1mg/L IBA过渡培养基：WPM+0.2mg/L ZT+0.1mg/L吲哚乙酸(IAA)不定芽诱导培养基：WPM+2.0mg/L 6‑BA+0.5mg/L KT+0.1mg/L IBA生根培养基：1/2WPM+1.0mg/L IBA培养基在高压灭菌前用氢氧化钾调整pH值至5.8；生根培养基蔗糖质量比用1％；(3)方法连续2‑3天的晴天后，于4‑8月份取悬铃木当年生枝条，2‑3个芽眼剪成一段，用75％乙醇灭30s，0.1％HgCl2灭菌10min，无菌水清洗3次，接种于腋芽启动培养基中培养；30天后，将诱导出的腋芽转接于微繁培养基上进行芽的快繁30天；然后采用壮苗培养基、过渡培养基及微繁培养基进行轮流继代培养，30天继代一次；微繁苗从微繁培养基上转至壮苗培养基需要将丛芽中超过1cm的小芽分成单株培养；从壮苗培养基上转至过渡培养基将丛芽分成单株培养；从过渡培养基转到微繁培养基上需要切除微繁苗所有展开叶片，并将小苗分单节切开；将过渡培养基上培养30天的悬铃木展开叶片，其中超过2厘米长的叶片横切成两块，叶背向下转接到不定芽诱导培养基；30天后，切取叶片边缘诱导的不定芽置壮苗培养基上进行壮苗培养；30天后，分开丛芽转接到过渡培养基上培养；20天后，将小苗转接到生根培养基上进行生根培养；30天后，移栽；26±2℃和16h光照/8h黑暗以及1600～2000lx光强下培养。