一种基于功能化金纳米颗粒的酪氨酸酶活性分析方法

摘要

本发明涉及一种基于功能化金纳米颗粒的酪氨酸酶活性分析方法，属于分析化学技术领域。本发明以两端均为酪氨酸的寡肽作为底物，典型的为酪氨酰酪氨酸（Tyr-Tyr）、或两个酪氨酸中间夹杂其他氨基酸残基的寡肽作为酪氨酸酶的底物，生成两端均带邻位羟基的桥联分子，该分子介导经16-巯基十六烷基酸及3-氨基苯基硼酸修饰的金纳米颗粒（APBA/MHDA/AuNPs）的聚集，根据随之产生的紫外-可见光谱的变化可以对酪氨酸酶的活性进行分析。该方法具有极高的灵敏度和良好的线性关系，为临床诊断和食品工业等领域快速、低成本定量分析酪氨酸酶活性提供有效的手段。

主权项

一种基于功能化金纳米颗粒的酪氨酸酶活性分析方法，其特征在于以两端均为酪氨酸的寡肽作为酪氨酸酶的底物，在酪氨酸酶的催化和有氧存在的条件下，生成两端带有邻苯二酚基团的衍生物，并进一步生成邻苯二醌衍生物，在加入抗坏血酸后，邻苯二醌衍生物重新还原生成邻苯二酚衍生物，后者能够作为配基与硼酸基团结合，从而当酪氨酸酶的产物两端带有邻苯二酚基团的衍生物存在时，作为桥联分子使得表面修饰有16‑巯基十六烷基酸MHDA及3‑氨基苯基硼酸APBA修饰的金纳米颗粒APBA/MHDA/AuNPs发生聚集，根据随之产生的紫外‑可见光谱的变化对酪氨酸酶的活性进行分析；方法包括以下步骤：功能化金纳米颗粒的制备，底物的选择和酶促反应，产物的还原，功能化金纳米颗粒的加入和紫外‑可见光谱表征；（1）功能化金纳米颗粒的制备：采用经典的柠檬酸钠还原法制备直径13 nm的金纳米颗粒AuNPs，17.5 nM金纳米颗粒溶液使用前通氮气5 min除去AuNPs溶液中的氧，将AuNPs溶液与吐温20在1 mM pH 7.0的磷酸盐缓冲液PBS中混合并放置20 min，使吐温20充分吸附至AuNPs表面，然后加入用无水乙醇配制的MHDA，使得混合液中各物质的终浓度分别为：AuNPs 1.5 nM，吐温20 2.0 mg/mL，MHDA 0.17 mM，在黑暗中静置4 h，使MHDA自组装到AuNPs表面得到MHDA/AuNPs；通过13000 rpm离心20 min除去未反应的吐温20和MHDA，用10 mM pH7.2的4‑(2‑羟乙基)哌嗪‑1‑乙磺酸HEPES缓冲液将MHDA/AuNPs重新悬浮；往MHDA/AuNPs悬浮液中加入APBA，偶联剂1‑[3‑(二甲氨基)丙基]‑3‑乙基碳二亚胺EDC和N‑羟基琥珀酰亚胺NHS至混合溶液中各物质的终浓度分别为：MHDA/AuNPs 2.5 nM，APBA 0.1 mM，EDC 0.8 mM，NHS 2.0 mM，在pH 5.0环境下搅拌反应3.5 h；通过13000 rpm离心20 min除去未反应的化合物，修饰好的APBA/MHDA/AuNPs悬浮于10 mM pH7.2的HEPES缓冲液中，4℃保存；（2）酶促反应条件如下：选择以两端均为酪氨酸的寡肽作为底物，典型的为酪氨酰酪氨酸Tyr‑Tyr，或两个酪氨酸中间夹杂其他氨基酸残基的寡肽，溶于50 mM、pH 6.5的PBS缓冲液中，将底物与待测酪氨酸酶混合，反应体系为100 μL，体系中底物浓度维持在0.5 mM，酶需要有合适的稀释倍数，于25℃有氧下准确反应30 min，然后加热至80℃使酪氨酸酶失活；（3）产物的还原条件如下：往反应体系里添加5 mM的抗坏血酸溶液50 μL，在室温下反应15 min；（4）功能化金纳米颗粒的加入和紫外‑可见光谱表征如下：往反应体系里添加100 μL浓度为9.5 nM的APBA/MHDA/AuNPs，混合均匀后静置15min，然后测定紫外‑可见光谱曲线，以曲线中530 nm处的吸光度数据分析酶活性。