一种简便的稻曲病菌快速分离法

摘要

本发明涉及一种简便、快速的微生物分离方法，尤其是一种快速分离稻曲病菌的方法，属于微生物技术领域。该方法将稻曲球在无菌水中刮洗除去稻曲球表层的杂菌，再用75％的乙醇溶液消毒30～60s、0.1％升汞水溶液浸泡消毒2～4min，用无菌水清洗，然后加入无菌水捣碎，用捣碎液冲洗分离用胁本哲氏培养基，风干培养基表面水份后，将培养皿置于恒温箱28℃中黑暗培养，培养第6天后，用尖头挑针挑取黄色或白色小菌落及白色菌丝移至培养用胁本哲氏培养基中纯化培养10天，再将稻曲病菌移至PSA斜面培养基中培养10天后即可得到相应的稻曲病菌。本发明在短期内可从稻曲球中大量、快速、有效地分离出稻曲病菌，能有效解决稻曲病菌其它分离法中存在的污染、耗时、可靠性差、纯化难度大等问题。

主权项

一种简便的稻曲病菌快速分离方法，其特征在于：按照以下步骤进行（1）稻曲球标样选择：选取从田间采集的新鲜黄色稻曲球，或4℃冰箱中保存2个月内的稻曲球；（2）单粒稻曲球消毒：在无菌水中刮洗除去稻曲球表层的杂菌5次，再用重量比为75%的乙醇溶液消毒30～60s、重量比为0.1%的升汞水溶液浸泡消毒2～4min和无菌水清洗3次；（3）稻曲球捣碎液制备：单粒稻曲球在无菌培养皿和4 mL的无菌水中，用无菌手术刀捣碎消毒好的稻曲球组织后，制备含厚垣孢子和组织碎块的稻曲球捣碎液；（4）稻曲球捣碎液冲洗平板：用移液枪吸取1mL捣碎液冲洗分离用胁本哲氏培养基表面，随后用移液枪吸去残余的捣碎液；（5）稻曲病菌分离：无菌通风条件下风干培养基表面水份后，将培养皿置于恒温箱28℃中黑暗培养，逐日观察分离结果；（6）稻曲病菌纯化：培养第6天后，用尖头挑针挑取黄色或白色小菌落及白色菌丝移至培养用胁本哲氏培养基中纯化培养10天；（7）稻曲病菌保存：依据病菌在培养基的生长特性及其显微观察结果，将稻曲病菌移至PSA斜面培养基中培养10天后，保存于4℃冰箱中；所述分离用胁本哲氏培养基配方为马铃薯300g、蛋白栋5g、蔗糖 15g、Ca(NO3)2·4H­­­2O 0.5g、Na­2HPO­­4·12H­20 2.0g、琼脂16g、加水定容至1000mL，在121℃下高压湿热灭菌20~25min，待培养基冷却至45℃~50℃时加入抑制细菌生长的氯霉素50µg/ml混匀，倒入培养皿中凝固后备用；所述培养用的培养基配方如下：培养用胁本哲氏培养基配方为马铃薯300g、蛋白栋5g、蔗糖 15g 、Ca(NO3)2·4H­­­2O 0.5g、Na­2HPO­­4·12H20 2.0g、琼脂16g、加水定容至1000mL，PSA固体培养基配方为马铃薯200g、琼脂20g、蔗糖20g、加水定容至1000mL，以上培养基均在121℃下高压湿热灭菌20min后备用。