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一种鸡下丘脑神经元体外培养方法，其特征在于包括以下步骤： 1）细胞培养板包被配制浓度为0.01～0.25mg/L的多聚赖氨酸(Sigma)溶液包被细胞培养板，六孔板，每孔2ml，置于37℃、5％CO2的培养箱中孵育2小时以上，最好过夜；然后用DMEM洗一遍，再用双蒸水洗1～3遍，然后置于培养箱中，待完全干燥后备用；2）基础培养液配制 用DMEM、胎牛血清Gibco和马血清Gibco配制基础培养液，各组分的体积百分比为：DMEM80～94%、胎牛血清5～15％和马血清1～5％； 3）样品采集取鸡下丘脑组织，用DMEM冲洗3‑4次；4）组织分散 将冲洗后的鸡下丘脑组织剪碎至1mm3大小，加浓度为0.1～0.25％的胰蛋白酶Solarbio溶液适量，37℃水浴5～15min；每隔3min剧烈摇晃一下；待鸡下丘脑组织块消化到几乎消失时，加入与胰蛋白酶等体积的步骤2）配制的基础培养液终止消化，然后过200目网筛，吸取悬浊液装入离心管，离心5～15min，600～1500rpm；弃上清液，加DMEM重悬，然后再离心5～15min，600～1500rpm； 5）细胞计数将步骤4）离心后的悬浊液弃上清液，用步骤2）配制的基础培养液重悬，再用0.4％的台盼蓝染色计数，计算悬浊液中活细胞比例、细胞总数，以及可接板数；根据计数结果，在悬浊液中加入步骤2）配制的基础培养液，使悬浊液中细胞浓度达到5～20×105个/ml； 6）细胞接种六孔细胞培养板每孔接种上述悬浊液2ml，接种24h后全换液，以后一周换两次液，每次均为半换液； 7）细胞纯化 如果细胞培养48～72h时，观察到有杂细胞如神经元胶质细胞存在，每孔加入适宜浓度的阿糖胞苷Sigma，处理12～48h后，用步骤2）配制的基础培养液完全换液。 |
