检测结核杆菌耐药基因膜芯片

摘要

一种检测结核杆菌耐药基因膜芯片，是针对结核杆菌rpoB、katG、embB、inhA、ahpC、gyrA、rrs、rpsL、pncA基因的突变位点，设计54个探针点样于尼龙膜上而构成，利用5’端带有生物素标记的12对特异引物，将样品DNA经三重PCR，扩增出大量带生物素的基因片段产物，扩增产物与膜芯片上的探针进行特异性杂交，再经过洗膜，酶联和显色反应即可。所述基因膜芯片及其检测方法，能够一次性检测结核杆菌对异烟肼、利福平、链霉素、乙胺丁醇、吡嗪酰胺、喹诺酮类药物耐药的常见基因突变，适用于体外检测痰样、临床分离株以及组织样本中结核杆菌耐多药基因。

主权项

一种检测结核杆菌耐多药的基因膜芯片，特征在于针对常见结核杆菌rpoB、katG、embB、inhA、ahpC、gyrA、rrs、rpsL、pncA基因的突变位点，设计54个检测探针，将探针点样于尼龙膜上构建成膜芯片，每一个被检测样本的DNA分4个反应管，每管加入三对不同的引物，共12对引物是分别针对结核杆菌rpoB、katG、embB、inhA、ahpC、gyrA、rrs、rpsL、pncA基因特异设计的，其中每对引物中的下游引物5’端均带有生物素标记，在同一PCR条件下4个反应管同时经三重PCR，扩增出大量带有生物素的结核杆菌相应的基因片段产物，将扩增产物与膜芯片上的探针进行特异性杂交，杂交后带有生物素的目标基因与探针牢牢的结合在一块，洗去未结合的扩增基因片段，再进行酶联和显色反应即可用肉眼判断结果；所述54个检测探针中52个为结核杆菌检测探针，2个为质控探针，所述52个结核杆菌检测探针中，包括14个检测结核杆菌耐异烟肼的探针，分别命名为kaN1、kaN2、ka315M、inN1、inN2、inN3、inN4、inN5、inN6、in‑15M、in94M、ahN1、ahN2、ah‑15M，其探针5’→3’序列分别为：TTTTTTTTTAAGACCCATGGCGCCGGCTTTTTTTTTTGCGATCACCAGCGGCATCTTTTTTTTTTGCGATCACCAMCGGCATCTTTTTTTTTTCGCGGCGAGACGATAGGTTTTTTTTTATCATCACCGACTCGTCGATCTTTTTTTTTGATTCAGCGCATCACCGACCTTTTTTTTTGGTGCTCACCGGGTTCGACTTTTTTTTGTGGTGCATTCGATTGGGTTCTTTTTTTTGGATGGGCATCAACCCGTTCTTTTTTTTTTTCGCGGCGAGATGATAGGTTTTTTTTTGTGGTGCATGCGATTGGGTTCTTGGTGTGATATATCACCTTTGCCTGACAGTTTTTTTTACTTCACGGCACGATGGAATGTTTTTTTTTACTTCATGGCACGATGGAATGT所述52个结核杆菌检测探针中，包括11个检测结核杆菌耐利福平的探针，分别命名为rpN1、rpN2、rpN3、rpN4、rpN5、rpN6、rp516M、rp526M1、rp526M2、rp531M1、rp531M2，其探针5’→3’序列分别为：TTTTTTTTGCCGCGATCAAGGAGTTCTTCTTTTTTTTGGCACCAGCCAGCTGAGCCAATTTTTTTTCATGGACCAGAACAACCCGCTGTTTTTTTTTCTGTCGGGGTTGACCCACAAGTTTTTTTTTTTTTCCGACTGTCGGCGCTGGTTTTTTTTTACGCGCGGGTCAACCCGTTTTTTTTTTTCATGGKCCAGAACAACCCGCTTTTTTTTTCTGTCGGGGTTGACCTACAAGCTTTTTTTTCTGTCGGGGTTGACCGACAAGTTTTTTTTTTTTGCCGACTGTTGGCGCTGGTTTTTTTTCGCCGACTGTGGGCGCTG所述52个结核杆菌检测探针中，包括7个检测结核杆菌耐链霉素的探针，分别命名为rlN1、rlN2、rl43M、rl88M、rrN1、rrN2、rrN3，其探针5’→3’序列分别为：TTTTTCCACCACTCCGAAGAAGCCGAACTCTTTTTTTTGTGAAGGACCTGCCTGGTGTGTTTTTCCACCACTCCGAGGAAGCCGAACTCTTTTTTTTGTGAGGGACCTGCCTGGTGTGTTTTTGGAGAAGAAGCACCGGCCAACTACGTTTTTTTGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACGTTTTTTCTCAAAGGAATTGACGGGGGCCCG所述52个结核杆菌检测探针中，包括6个检测结核杆菌耐乙胺丁醇的探针，分别命名为emN1，emN2，emN3，em306M1，em306M2，em306M3，其探针5’→3’序列分别为：GGCATGGCCCGAGTCGCCTTTTTTTTTTTTTTTTGCCGGCTACATGTCCAACTATTTTTTTTTGAGGATCCCTTCGGCTGGTATGGCSTGGCCCGAGTCGCCTTTTTTTTGGCATWGCCCGAGTCGCCGTTTTTTTTGGCATCGCCCGAGTCGCCTTTTTTTT所述52个结核杆菌检测探针中，包括12个检测结核杆菌耐吡嗪酰胺的探针，分别命名为pnN1，pnN2，pnN3，pnN4，pnN5，pnN6，pnN7，pnN8，pnN9，pnN10，pn12M，pn85M，其探针5’→3’序列分别为：TTTTTTTTGAACGTATGGTGGACGTATGCTTTTTTTTGACGTGCAGAACGACTTCTGCTTTTTTTTTGGCAACCAAGGACTTCCACATTTTTTTTTCGACCCGGGTGACCACTTCTTTTTTTTTGACTATTCCTCGTCGTGGCCATTTTTTTTGCATTGCGTCAGCGGTACTCCTTTTTTTTGACTTCCATCCCAGTCTGGACTTTTTTTTGTGGTCGGTATTGCCACCGATTTTTTTTTCATTGTGTGCGCCAGACGGCCTTTTTTTTAGGGTGCTGGTGGACCTGACATTTTTTTTGACGTGCAGAACGCCTTCTGCTTTTTTTTGACTTCCATCCCAGTCGGGAC所述52个结核杆菌检测探针中，包括2个检测结核杆菌耐喹诺酮类的探针，分别命名为gyN1，gyN2，其探针5’→3’序列分别为TTTTTTTTCCCGCACGGCGACGCGTCGA，TTTTTTTCGATCTACGACAGCCTGGTGCGC；所述2个质控探针分别为质控探针P和N，其探针5’→3’序列分别为BIO’+CGCAGCGAGAGGTCAGTGG，TTTTTTTGTCCGAGCCGAGCATACGAG；所述12对引物的5’→3’序列如下：扩增katG基因上游引物P1序列为：TCGGCGGTCACACTTTCGGTA，下游引物P2序列为：BIO’+CGCAGCGAGAGGTCAGTGG；扩增inhA基因片段1的上游引物P1序列为：CGGAAATCGCAGCCACGTTA，下游引物P2序列为：BIO’+CAGGACTGAACGGGATACGAA；扩增inhA基因片段2上游引物P1序列为：GCCACTGACACAACACAAGGA，下游引物P2序列为：BIO’+ACGAATACGCCGAGATGTGGA；扩增OxyR‑ahpC基因上游引物P1序列为：GCTTGCGGCACTGCTGAAC，下游引物P2序列为：BIO’+CACCACCCGCCACTTGCCT；扩增rpoB基因上游引物P1序列为：GGAGCGGATGACCACCCAGGAC，下游引物P2序列为：BIO’+CGTCGGCGGTCAGGTACAC；扩增embB基因上游引物P1序列为：CGCACCTTCACCCTGACCGAC，下游引物P2序列为：BIO’+ATCAGCGCCAGCAGGTTGTA；扩增rpsL基因上游引物P1序列为：TCGTCGGGACAAGATCAGTAA，下游引物P2序列为：BIO’+CTTGACACCCTGCGTATCCA；扩增rrs基因片段1的上游引物P1序列为：ACGAAGGTCCGGGTTCTCTC，下游引物P2序列为：BIO’+GCATTCCACCGCTACACCA；扩增rrs基因片段2上游引物P1序列为：AGGCGGGTCTCTGGGCAGTAA，下游引物P2序列为：BIO’+TGCACACAGGCCACAAGGGAA；扩增pncA基因片段1的上游引物P1序列为：GTCGCCCGAACGTATGGTG，下游引物P2序列为：BIO’+CGAAGCCGCTGTACGCTCC；扩增pncA基因片段2上游引物P1序列为：CGACGAGAACGGCACGCCACT，下游引物P2序列为：BIO’+GCTGCAAACCAACTCGACGCT；扩增gyrA基因上游引物P1序列为：ACCGCAGCCACGCCAAGTC，下游引物P2序列为：BIO’+CGGGCTTCGGTGTACCTCATC。